罗燕娜，刘江娜，王 航
（兵团第六师农业科学研究所，新疆 五家渠 831300）
收稿日期：２０15—01—20
摘要：本文对北疆地区马铃薯主要病毒的特性和致病症状进行了描述，并简要介绍了马铃薯主要病毒的检测技术。
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关键词 ：马铃薯；病毒；检测方法
马铃薯在我国广泛种植，已成为仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物。由于光照强、昼夜温差大、气候冷凉等优势，新疆北疆沿天山一带的昌吉州、乌鲁木齐、昭苏、新源等地都非常适宜种植马铃薯，现种植面积已达2310hm2[1]。然而在当前的马铃薯生产中，病毒病发生普遍而严重，成为制约马铃薯产业发展的主要障碍，是生产上亟待解决的突出问题[2]。目前，已报道的马铃薯病毒种类超过25种、类病毒1种，其中，侵染乌鲁木齐地区马铃薯的主要病原病毒有PVX、PVY、PVA、PLRV,类病毒为PSTVd。主要检测的马铃薯病毒有马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）及马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）[1]。
1马铃薯主要病毒种类及致病症状
1.1马铃薯X病毒（PVX）
X病毒又称普通花叶病毒，病毒粒子为长杆状，大小为515nm×13nm，基因组全长6.4kb[3]。该病毒可通过叶片汁液摩擦传播，也可通过蚜虫以非持久性方式传播，还可通过种薯传播[1]。感病植株症状多种多样，因栽培品种的敏感性不同和病毒株系的不同而存在差异，多数表现为轻花叶或潜隐症状，症状严重的则表现为严重的花叶或皱缩，产量损失可达50%。
1.2马铃薯Y病毒（PVY）
Y病毒又称为重花叶病毒，病毒粒子形状为弯曲的线形，大小为750nm×11nm，多数通过桃蚜和大戟长管蚜传播。PVY包括3个株系组：马铃薯Y病毒普通株系组（PVYO）、马铃薯点条斑株系（PVYC）和马铃薯Y病毒褐脉株系（PVYN）。前2个株系组引起的主要初期症状是叶片坏死、斑驳，后期则表现为矮化、皱缩、斑驳和卷曲；第3个株系组初期表现为不同程度的花叶，后期为花叶和斑驳，当温度低于10℃或高于25℃时，花叶症状消失。产量损失最高可达80%。通常该病毒不会引起块茎发病，但近年来欧洲出现的一个新株系PVYNTN，则可在块茎上导致坏死环斑[4]。
1.3马铃薯A病毒（PVA）
A病毒又称为轻花叶病毒，病毒粒体为弯曲的线形，大小为730nm×15nm，基因组全长9.7kb。该病毒可通过汁液摩擦传播或由蚜虫以非持久性方式传播，也可通过种薯传播。感病植株的症状表现为脉间花叶、叶片有光泽、叶脉深陷和叶边缘粗缩，产量损失可达40%。
1.4马铃薯S病毒（PVS）
S病毒又称为潜隐性花叶病毒，病毒粒子形状为线形，大小为650nm×12nm，病毒基因组全长7.4kb。可通过汁液摩擦传播，也可通过蚜虫传播。感病植株初期症状不明显，严重危害时，叶片呈青铜色，叶脉轻微下陷，植株的开张度较大。一些品种上会出现坏死斑和条纹。在田间常与其他病毒混合侵染，当与PVX或PVM病毒混合侵染时，可减产20%~30%[5]。
1.5马铃薯M病毒（PVM）
M病毒也属于香石竹潜隐病毒属（Carlavirus）。病毒粒子为线形，大小为650nm×12nm，该属病毒基因组全长8.5kb。可通过机械传播，或者通过蚜虫以非持久性方式传播，也可通过种薯的调运远距离传播。感病植株叶上表面的叶脉深陷，有的出现粗缩，叶片轻微下垂，顶部叶片呈开散状。
1.6马铃薯卷叶病毒（PLRV）
PLRV属于马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus），病毒粒子为六边形等轴对称，直径24nm~26nm，基因组全长5.9kb。主要由蚜虫传播，也可通过种薯传播。感病植株发病较轻时表现为幼叶褪绿、卷曲，叶基常有紫红色边缘。发病较重时，植株矮化，叶片上卷并革质化，产量损失可达70%[1]。
2马铃薯病毒检测方法
因马铃薯茎尖脱毒培养过程中各环节都会有误差，所以在茎尖苗扩繁之前必须对马铃薯苗进行严格的病毒学检测，确定不带病毒后才能进一步扩繁。除此之外，还必须抽样检查以下几种情况：瓶苗下地之前、组培苗扦插结束、试管薯出苗后30~40d、现蕾期至盛花期、收获前30d左右、收获后和种薯出库前。因此，在马铃薯脱毒种薯培育过程中，准确可靠的病毒检测方法与高效的脱毒方法同等重要[6]。
目前，北疆地区常用的马铃薯病毒检测方法是酶联免疫吸附法（双抗体夹心法（DAS-ELISA））。该检测方法的主要操作过程有以下几步。
2.1准备工作
实验前，在设计图表上注明各反应孔的位置，以避免出错。在密封塑料盒底部铺1张吸水纸，倒入适量蒸馏水使之刚好润湿，即为恒湿箱，孵育用。微孔板为可拆卸，根据用量取出所需数量的微孔，未使用完的微孔密封好，4℃下保存。
2.2样品的提取及稀释
尽可能选择出现症状的植物组织作为样品，通常将叶片作为ELISA实验的检测样品，其它植物组织也可用于ELISA实验。使用通用样品提取缓冲液来碾磨稀释样品。若用研钵提取样品，在每份样品提取后彻底清洗研钵，以免造成样品间的相互污染。
将样品与通用样品提取缓冲液以1∶10（样品重量（g）∶提取缓冲液体积（mL）的比例研磨样品。
每个反应孔需要100μL的样品提取稀释液。多制备一些样品提取稀释液以利于吸取。
2.3点样
根据实验设计，取100μL样品提取稀释液到各样品孔中，取100μL阴性质控物溶液到阴性对照孔中，取100μL阳性质控物溶液到阳性对照孔中。
2.4准备酶标结合物
检测抗体和酶标抗体均为浓缩液体，应根据标签上的稀释倍数用ECM缓冲液稀释。根据酶标记物标签上的稀释倍数将酶标记物和检测抗体（瓶A和瓶B）加到1倍的ECM缓冲液中，混合均匀。1μL的检测抗体稀释液可供8个反应孔使用，10μL的酶标记物稀释液可供96个反应孔使用。
2.5洗板
孵育结束后，将反应孔中的试剂倒出，加入250μL的1倍PBST缓冲液，之后快速倒出，重复7次，将微孔板倒扣在吸水纸上以控干孔中残留液体。
2.6加酶标结合物
在各反应孔中加入100μL配置好的酶标结合物溶液。
2.7孵育
室温下（25℃）在恒湿箱中孵育2h。
2.8PNP底物的制备
孵育结束前15min制备PNP底物溶液。在室温下用5mLPNP缓冲液溶解1片PNP底物片。每片PNP底物片可溶解成5mL的底物溶液，溶解比例为1mg/mL，可供40个反应孔使用。在室温下用5mLPNP缓冲液（1倍浓度）溶解1片PNP底物片。
2.9洗板、加PNP底物溶液
洗板步骤同2.5，重复8次。在各反应孔中加入100μLPNP底物溶液。
2.10孵育
在恒湿箱中孵育60min，避免阳光直射或强光照射。
2.11结果分析
直接用肉眼观察或用酶标仪在405nm波长下测量结果。
阳性结果：微孔中有明显颜色变化；阴性结果：微孔中没有明显颜色变化。只有在阳性质控孔得到阳性结果的时候，实验结果才是可靠的。结果可保持1h左右（只要阴性质控孔不发生颜色变化）。
3结语
建议种薯加工企业在3个环节上进行质量检验：（1）核心种苗必须进行病毒检测，检测方法可采用DAS-ELlSA。（2）田间检验。全部植株目测检查3次，目测不能确诊的非正常植株采集样本进行实验室检验，种薯每批次至少随机抽检5~10点，每点100株，各指标可参照GB18133-2012标准[7]。（3）块茎检验包括收获后检测和库房检验，原原种每个品种每100万粒检测200粒，大田每批种薯根据生产面积确定检测样品数量，种薯出库前应进行库房检查，抽样及检验样品数量参照GB18133-2012标准，并采用目测法检测窖藏病害及混杂等情况。
目前，应用于马铃薯病毒的免疫学检测技术以ELISA技术最成熟，应用最广泛。多年来，这项技术被不断改进和创新，现已形成直接酶联检测法、间接酶联检测法（I-ELISA）、双抗体夹心法（DAS-ELISA）、三抗体夹心法（TAS-ELISA）等多种检测方法[8]。双抗体夹心法（DAS-ELISA）与其他检测方法相比较，有突出的优点：一是灵敏度高，检测浓度可达l~10ng/mL；二是快速，几个小时内即可出结果；三是专化性强，重复性好；四是检测对象广，粗汁液或提纯液都可检测，一般不受抗原形态的影响，无论是完整的还是降解的病毒粒体都可检测；五是可处理大批样品，适合种薯生产中大量样品的多种马铃薯病毒的快速检测。但也存在一些缺点：检测病毒时会出现假阳性反应，准确性降低；病毒浓度低，当年不显症时无法检测；无法检测类病毒。
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参考文献
[1]董代幸.乌鲁木齐地区马铃薯病毒和类病毒的分子鉴定及检测技术研究[D].新疆农业大学，2010.
[2]李济宸，唐玉华，谭宗九，等.马铃薯病害及其防治[M].石家庄：河北科学技术出版社，1992.
[3]王春香，高谦，潘乃穟，等.马铃薯X病毒外壳蛋白基因的cDNA克隆和全序列测定[J].植物学报，l991，33（5）：363-369.
[4]李入贤，张文龙，施文娟.马铃薯脱毒种薯（苗）病毒检测技术研究进展[J].种子，2009，28（4）：60-62.
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[6]聂峰杰，张丽，宋玉霞，等.宁夏马铃薯脱毒种薯生产及病毒检测技术的现状和发展途径[J].中国种业，2014（7）：17-21.
[7]王怀栋，黄修梅，李明.浅谈马铃薯脱毒种薯质量控制[J].黑龙江农业科学，2012（3）：116-119.
[8]毛彦芝.马铃薯病毒检测技术的研究概况[J].中国蔬菜，2009（12）：1-6.