刘迎春，曹 宇，张建新，张 娜，毕林杰，刘 甜，陈建军
（河南师范大学生命科学学院，河南 新乡 ４５３００７）
摘要：研究采用乳酸菌（Ｌａｃｔｏｔａｃｉｌｌｕｓ）、屎肠球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）和酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ），通过不同组合优化豆粕固态发酵，在接种量相同、发酵时间不同的条件下，以未发酵豆粕为对照，测定各组的蛋白质、脂肪、水分、灰分含量，选出最佳发酵方案。研究表明，不同组合的菌种及不同的发酵时间对发酵豆粕品质的影响存在交互作用。不同菌种组合营养成分增加量不同，其中乳酸菌∶屎肠球菌∶枯草芽孢杆菌＝１∶１∶１组增长最为明显，随着发酵时间的增加，其蛋白质含量呈先上升后下降趋势，在发酵第五天时达到最高点，显著高于对照和其他组合，较０ ｄ时提高了２４．３８％；灰分含量较低，较０ ｄ时降低了８．８９％，可作为豆粕发酵的适宜菌种组合。并利用ＨＰＬＣ同时测定未发酵豆粕和发酵最优豆粕中水苏糖和棉子糖含量。结果显示，发酵最优豆粕中水苏糖和棉子糖含量显著降低，可有效缓解动物食用后的消化不良、胀气等问题。
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关键词 ：豆粕；混合菌发酵；水苏糖；棉子糖；ＨＰＬＣ
中图分类号：Ｓ８１６．４２；ＴＳ２１４．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）１６－４００７－０５
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．１６．０４５
收稿日期：２０１５－０５－２８
基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目（２０１３１０４７６１０７）；河南省重点科技攻关计划项目（１２２１０２２１０１６８）
作者简介：刘迎春（１９９１－），女，河南周口人，在读本科生，专业方向为应用微生物，（电话）１８７９０６９２７６８（电子信箱）ｙｃｌｉｕ１９９２＠１６３．ｃｏｍ；
通信作者，陈建军，男，副教授，主要从事微生物遗传及分子微生物学方面的研究，（电子信箱）１３６１３７３４０７２＠１６３．ｃｏｍ。
中国是养殖大国之一，同时也是饲料原料特别是蛋白质原料的需求大国［１］。近年来，随着中国饲料工业的蓬勃发展，豆粕作为饲料工业中应用最为广泛的植物性蛋白质原料的供应量也在逐年增长［２］，由于其兼具赖氨酸含量高、货源充足等优点，成为目前畜牧养殖业使用量很大的优质蛋白质源之一。然而，由于豆粕中抗营养因子的存在以及其适口性差等问题影响了豆粕的应用价值［３］。大豆低聚糖（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎｓ，ＳＢＯＳ）是一类存在于大豆中的低分子糖，其主要成分是蔗糖（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、水苏糖（Ｓｔａｃｈｙｏｓｅ）和棉子糖（Ｒａｆｆｉｎｏｓｅ）。由于不能被胃和小肠中的消化酶消化，只能被结肠中的细菌发酵产生气体，引发动物胃肠胀气［４］，使其在动物体内的消化率吸收率下降。
利用微生物发酵豆粕，成本低，对饲料营养成分的影响与破坏小，可以消除豆粕中胰蛋白酶抑制剂、低聚糖和植酸等的不利影响，有效缓解并消除动物食用后产生的消化不良、胀气等问题，提高各类物质的营养价值［５］，同时还可以积累有益的代谢产物和益生菌［６］。此外，豆粕为微生物生长提供了天然的碳源及氮源，经过改造可配成适宜益生菌繁衍的培养基，将“废弃物”变成优质饲料产品，是解决中国饲料蛋白质不足的快捷、经济、有效的途径，对于当前饲料行业缓解鱼粉紧张的局面具有积极的意义。
本研究拟采用混合菌对豆粕进行发酵， 以降解豆粕中大分子蛋白质和降低抗营养因子的含量，最终得到一种有利于动物消化吸收和生长发育等功效的豆粕发酵蛋白饲料。并利用ＨＰＬＣ同时测定未发酵豆粕和发酵豆粕中水苏糖和棉子糖的含量，为发酵豆粕作为生物饲料的应用提供理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料与试剂
豆粕由焦作恒辉饲料厂提供；牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、吐温８０、磷酸二氢钾、三水乙酸钠、柠檬酸三铵、七水硫酸镁、一水硫酸镁、氯化钠、甘油磷酸钠、溴甲酚紫、叠氮钠、ＴＴＣ等均由河南师范大学微生物实验室提供；凯氏定氮所需试剂：硫酸钾（分析纯）、硫酸铜（分析纯）、浓硫酸（９８％）、硼酸（４％）、０．２ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ７．４的磷酸缓冲液；三氯醋酸；１０％三氯乙酸；混合指示剂（０．１％甲基红乙醇溶液和 ０．５％溴甲酚绿乙醇溶液按１∶１混合）；高效液相色谱所需试剂：水苏糖、棉子糖标准品为Ｓｉｇｍａ公司色谱纯产品；乙腈、９５％乙醇、三蒸水均为色谱纯；其他试剂均为分析纯；０．４５ μｍ有机滤膜。
１．２ 仪器设备
分析天平（精度为０．０００ １ ｇ）；高温电炉（可控温在１ ６００ ℃）；高压灭菌锅；超净工作台；电热恒温培养箱（ＳＧＳＰ－０２０）；摇床；ＦＯＳＳ全自动凯氏定氮仪；量筒；容量瓶；烧杯；移液管；电子天平等；真空抽滤泵；高效液相色谱仪；色谱柱：氨基柱Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｃ （４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ，５ μｍ）；ＲＩＤ检测器；电烘箱；干燥器；铝盒；研钵或粉碎机等。
１．３ 试验方法
１．３．１ 菌种及培养基制备 乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母菌（Saccharomyces）、屎肠球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）均来自于河南师范大学微生物实验室。
斜面培养：将酵母菌、屎肠球菌、乳酸菌和枯草芽孢杆菌进行斜面活化，其中酵母菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ）活化，枯草芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨斜面进行活化，乳酸菌和屎肠球菌在ＭＲＳ琼脂培养基斜面活化，在３０ ℃恒温培养箱中培养７２ ｈ。
种子培养：挑取经过活化的菌种，制成菌悬液，酵母菌在１００ ｍＬ ＰＤＡ液体培养基扩大培养；枯草芽孢杆菌在５０ ｍＬ牛肉膏蛋白胨中培养；乳酸菌和屎肠球菌在５０ ｍＬ ＭＲＳ液体培养基３０ ℃恒温培养箱中扩大培养７２ ｈ。
固体发酵培养基：称取１ ｇ硫酸铵、１ ｇ尿素和１ ｇ磷酸二氢钾置于１００ ｍＬ烧杯中，加入４０ ｍＬ去离子水溶解后，加入盛有４７ ｇ豆粕的发酵培养皿中混合均匀，１２１ ℃下湿热灭菌３０ ｍｉｎ。将不同种类的菌种接种到固体培养基中，培养９６ ｈ。
１．３．２ 豆粕成分分析 粗蛋白质含量测定：半微量凯氏定氮法（ＧＢ／Ｔ６４３２－２００６）；灰分含量测定：５５０ ℃灼烧法（ＧＢ／Ｔ６４３８－２００７／ＩＳＯ ５９８４：２００２）；粗脂肪含量测定：索氏抽提法（ＧＢ／Ｔ６４３３－２００６）；水分含量测定：１０５ ℃恒重法（ＧＢ／Ｔ６４３５－２００６）；水苏糖、棉子糖含量测定：高效液相色谱法［７］
１．３．３ 豆粕固态发酵 试验设置３个试验组，每组设置３个平行（表１），以未发酵为对照。根据表１的试验安排，每试验按照不同组合接种后，搅拌均匀，置于 ３０ ℃恒温培养箱中培养，分别在０、３、５、７ ｄ取样测定其蛋白质、水分、灰分和脂肪含量，发酵时间共持续７ ｄ。
１．３．４ 蛋白质的测定 凯氏定氮法［８］测蛋白质含量。称取５.0 ｇ粉碎后的样品，移入干燥的５００ ｍＬ定氮瓶中，加入０．５ ｇ硫酸铜、１０ ｇ硫酸钾稍摇匀后，置于ＦＯＳＳ全自动凯氏定氮仪的消化器中进行消化，待溶液消化至澄清且蓝绿色后自然冷却；然后将冷却后的定氮瓶移入ＦＯＳＳ全自动凯氏定氮仪的蒸馏器中，用盛有５０ ｍＬ ４％的硼酸溶液和１０滴混合指示剂的２５０ ｍＬ锥形瓶接收馏出物，收集约１５０ ｍＬ馏出物；最后用０．０８９ ３７ ｍｏｌ／Ｌ的盐酸溶液滴定收集液，至溶液的颜色恰好从蓝绿色变为酒红色为止。
空白试验：约０．５ ｇ蔗糖，按上述操作方法做空白试验，消耗的 ０．０８９ ３７ ｍｏｌ／Ｌ 的盐酸溶液为０．２ ｍＬ。
结果按下式计算：
式中，Ｃ为盐酸标准溶液的浓度，ｍｏｌ／Ｌ；Ｖ１为空白试验滴定消耗的盐酸标准溶液体积，ｍＬ；Ｖ２为样品滴定消耗的盐酸标准溶液体积，ｍＬ；ｍ为样品的质量，ｇ；０．０１４为氮的摩尔质量，ｇ/ｍｍｏｌ；６．２５为氮换算成粗蛋白质的系数。
１．３．５ 脂肪的测定 将盛有滤纸包的培养皿移入（１０５±２） ℃烘箱中干燥２ ｈ，取出，冷却，称重（记作ａ），然后装入３ ｇ左右研细的样品，封好，（１０５±２）℃干燥３ ｈ，冷却，称重（记作ｂ）。抽提，称重：待乙醚挥发之后，将滤纸包置于（１０５±２） ℃烘箱中干燥２ ｈ，放入干燥器冷却至恒重为止（记作ｃ）。
粗脂肪含量＝（ｂ－ｃ）/（ｂ－ａ）×１００％
式中，ａ为称量瓶加滤纸包重（ｇ）；ｂ为称量瓶加滤纸包和烘干样重（ｇ）；ｃ为称量瓶加滤纸包和抽提后烘干残渣重（ｇ）。
１．３．６ 水分的测定 称取５.0 ｇ样品于已烘至恒重的铝盒中，将铝盒盒盖套在盒底下，在电烘箱温度升至１０５ ℃左右时放入样品并烘３ ｈ，取出试样，立即盖好盒盖，放入干燥器内，冷却至室温称重，再复烘１ ｈ，取出冷却称重，直至前后两次质量之差不超过０．００５ ｇ，即为恒重。如果后一次质量高于前一次质量，以前一次质量为准。
计算公式如下：
式中，Ｘ为试样的水分含量，％；m1为干燥后试样的质量，ｇ；ｍ为试样的质量，ｇ。
１．３．７ 灰分的测定 称取３.0 ｇ试样于已恒重的坩埚中，然后放在万用电炉上，把坩埚盖错开约０．５ ｃｍ，加热至试样完全炭化至无烟为止。将炭化好的试样送入高温电阻炉口片刻，再移入炉中，错开坩埚盖，关闭炉门，在５００～５５０ ℃的电炉内灼烧２ ｈ，灼烧中为使坩埚受热均匀，可将坩埚调换２次，灼烧至黑点消失为止，取出坩埚，冷却称重，然后再复灼烧，取出坩埚冷却称重。直至前后两次质量相差不超过０．２ ｍｇ为恒重。
湿物质的灰分按下式计算：
式中，Ａ１为试样湿基灰分含量，％；Ａ２为试样干基灰分含量，％；X为试样水分含量，％；ｍ０为灰分质量，ｇ；ｍ为试样质量，ｇ。
１．４ 水苏糖、棉子糖的测定
１．４．１ 色谱条件 色谱柱：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｃ柱（４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ，５ μｍ）；流动相为乙腈∶水（８０∶２０）；柱温３５ ℃；流速１．０ ｍＬ/ｍｉｎ；进样量为２０．０ μＬ；示差折光检测器［9］，检测池温度３５ ℃。
１．４．２ 标准溶液配制 分别称取水苏糖、棉子糖标准品（含量≥９８％）各０．０２ ｇ置于５ ｍＬ容量瓶中，用去离子水溶解并稀释至刻度，摇匀经０．４５ μｍ滤膜过滤，滤液供ＨＰＬＣ分析用。
１．４．３ 样品制备 精确称取５．００ ｇ未发酵豆粕和发酵最优豆粕样品，粉碎后用石油醚回流除去脂肪，以料液比１∶９加入８０％乙醇溶液，于６０ ℃搅拌提取１ ｈ，抽滤，滤渣用同样方法提取２次，合并滤液。滤液用１０％的醋酸铅溶液沉淀蛋白，离心，重复２次至蛋白除尽，再用草酸除铅至无铅为止，滤液采用真空浓缩，转移至２５ ｍＬ容量瓶，供ＨＰＬＣ分析用。
１．４．４ 测定方法 分别取水苏糖、棉子糖标准溶液注入液相色谱仪，进行高效液相色谱分析，测定各组分色谱峰面积，以糖含量质量对相应的峰面积作标准曲线。在相同的色谱分析条件下，取２０ μＬ试样溶液注入高效液相色谱仪分析，测定各组分色谱峰面积，与标准曲线比较确定进样液中水苏糖、棉子糖含量。
２ 结果与分析
２．１ 豆粕发酵后成分分析
２．１．１ 发酵豆粕的蛋白质含量 由表２可知，在发酵０ ｄ时，各组蛋白质含量相差不大；３ ｄ时，各组蛋白质含量均有所增加，Ｂ组蛋白质含量最多，Ｃ组次之；５ ｄ时，各组蛋白质含量持续增加，Ｂ组蛋白质含量仍然最多，Ａ组次之，Ｃ组无明显变化；７ ｄ时，蛋白质含量均有所下降，Ｂ组仍最高。由以上分析可知，当发酵到第五天时，Ｂ组菌种组合蛋白质含量提高最多，较0 d时提高了24.38％。
２．１．２ 发酵豆粕的脂肪含量 由表３可知，在发酵０ ｄ时，对照组脂肪含量略高；３ ｄ时，Ａ组、Ｃ组脂肪含量均有所下降，Ｂ组脂肪含量增加较为明显；５ ｄ时，各组脂肪含量均有所增加，Ｂ组脂肪含量最高；７ ｄ时，Ａ组有所增加，Ｂ、Ｃ组变化不明显，Ｂ组含量最高。由以上分析可知，当发酵至第五天时，Ｂ组菌种组合脂肪的含量最高。
２．１．３ 发酵豆粕的水分含量 由表４可知，在发酵０ ｄ时，Ｃ组水分含量明显高于其他组；３、５ ｄ时Ｂ组和对照组有所增加，Ｃ组略微下降，Ｃ组在第七天有所增加；Ｂ组在第０ ｄ水分含量适中，第三天略微增加，第五天增加迅速，第七天略有下降。
２．１．４ 发酵豆粕的灰分含量 由表５可知，在发酵０ ｄ时，各组灰分含量相差不大；３ ｄ时，各组灰分含量均有所下降，Ｂ组灰分含量最低，Ｃ组次之；５ ｄ时，各组灰分含量持续下降，Ｂ组灰分含量仍然最低，Ａ、Ｃ组次之；７ ｄ时，各组灰分含量略微上升，排序为：Ｂ组＜Ａ组＜对照组＜Ｃ组。由以上分析可知，当发酵至第五天时，Ｂ组菌种组合灰分含量降低最多，可达8．８９％。
２．２ 水苏糖、棉子糖的测定
２．２．１ 水苏糖、棉子糖的标准曲线 由以上分析可知，Ｂ组（乳酸菌＋屎肠球菌＋枯草芽孢杆菌）发酵豆粕效果最好，利用ＨＰＬＣ同时测定未发酵豆粕和Ｂ组发酵豆粕水苏糖和棉子糖含量。所得水苏糖、棉子糖的标准曲线见图１。图１中，Ａ为水苏糖的直线回归，方程为Ｙ＝２６４．０１０ ７４ｘ＋１ ３４１．２１６ ３５，ｘ为水苏糖的含量；ｙ为水苏糖峰面积，Ｒ２＝０．９９９ ９３；Ｂ为棉子糖的直线回归，方程为Ｙ＝２６９．１５９ ５２ｘ＋
２ １７２．０２８ ４３；ｘ为棉子糖的含量；ｙ为棉子糖峰面积，Ｒ２＝０．９９９ ９６。水苏糖和棉子糖在１～１０ ｍｇ／ｍＬ范围内线性均良好，相关系数分别为０．９９９ ９３、０．９９９ ９６。大豆中抗营养因子是影响大豆蛋白源在饲料中使用的主要因素，主要成分为低聚糖（包括棉子糖和水苏糖）。研究表明，当饲料中水苏糖含量为１．０％时，试验动物的生长受到显著抑制，由于人或动物缺乏α－半乳糖苷酶，所以不能水解、吸收棉子糖和水苏糖。它们进入大肠后，被肠道微生物发酵产气，引起消化不良、腹胀、肠鸣等症状［１0］使干物质消化率显著下降。采用混合菌发酵可产生水解酶、发酵酶和呼吸酶，使大豆抗营养因子失活、钝化，消除了植物蛋白质原料中的抗营养物质，利于动物的消化吸收，有效提高了豆粕的利用率，增加了大豆蛋白质在饲料中的使用量。
２．２．２ 色谱分离 采用上述分析条件，柱温选定为３０ ℃，棉子糖和水苏糖分离良好，两者的保留时间分别为１０．７７８、１１．９９６ ｍｉｎ（图２）。利用ＨＰＬＣ同时测定未发酵豆粕和发酵最优豆粕中水苏糖和棉子糖含量（表６）。由表６可知，发酵最优豆粕中水苏糖和棉子糖含量显著降低，Ｂ组水苏糖含量较未发酵降低了５９．０４％，棉子糖降低了１１．１１％；发酵后的豆粕能有效消除抗营养因子的不利作用，提高豆粕质量。
３ 小结与讨论
由３组混菌发酵结果可知，经过微生物发酵后的豆粕营养成分都有不同程度的提高，其中Ｂ组（乳酸菌＋屎肠球菌＋枯草芽孢杆菌）发酵豆粕效果最好，Ｂ组蛋白质含量较发酵之前提高最多，可达24.38％。豆粕经乳酸菌发酵后有酸甜芳香的气味，ｐＨ下降，能有效改善其适口性，促进畜禽的食欲，同时可以降低抗生素、酸化剂的添加量，提供营养物质，促进机体生长，还可提高矿物元素的生物活性，进而提高了豆粕的营养。屎肠球菌可把部分蛋白质分解成酰胺和氨基酸，把大部分碳水化合物的无氮浸出物转化为乳酸，使豆粕里的纤维变软，并且在屎肠球菌的生理作用下通过催化、水解等反应分泌出Ｌ－乳酸，它可以与钙质合成Ｌ－乳酸钙，促进动物对钙质的吸收。枯草芽孢杆菌是好氧菌，繁殖过程中产酸、酶和多种维生素，其中很多是动物本身不具有的酶，如降解豆粕中复杂糖类果胶酶、葡聚糖酶和纤维素酶等［11］。在初始培养条件下，枯草芽孢杆菌迅速生长，为之后厌氧菌乳酸菌提供良好的生长环境，3种菌种产生的代谢产物发生互补效应，产生了更丰富的酶系，利于微生物的增长，从而使可利用的蛋白质含量有较高的增长。
混菌发酵豆粕可降低水苏糖、棉子糖含量，水苏糖含量较未发酵降低了５９．０４％，棉子糖含量降低了１１．１１％。微生物是良好的单细胞蛋白质来源，可提高饲料中的蛋白质含量，采用独特的菌种和发酵工艺，利用菌种间交互作用，使豆粕本身的蛋白质含量进一步提高。饲料原料的营养价值不仅取决于营养成分的高低，而且取决于动物对营养成分的吸收和利用能力。利用微生物混合菌种发酵豆粕，微生物可以有效地利用豆粕中不易被动物消化吸收的水苏糖、棉子糖等抗营养因子来进行生长、繁殖，从而降低豆粕中的抗营养成分，提高了动物食用后的吸收利用率，打破了豆粕在饲料等领域应用的局限性，提高了豆粕的经济价值。目前，大豆低聚糖的检测方法主要有高效液相色谱法和高效气相色谱法，这两种方法都具有既可定性又可定量的优点。其中高效气相色谱法测定大豆低聚糖，使用的溶剂毒性较大，还需进行衍生化处理，且易造成溶剂拖尾，操作繁琐。高效液相色谱法测定大豆低聚糖采用常规溶剂，样品处理简单，分离效果好，准确可行，重现性及回收率均比ＧＣ法好［１2］。
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