李 林，陈益燕，杨 梅
（广西大学林学院，南宁 ５３０００４）
摘要：以珍贵树种土沉香（Ａｑｕｉｌａｒｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）幼茎为材料，研究土沉香启动培养中外植体消毒的最适方法和芽诱导、愈伤组织诱导的最适培养基，植株不同部位的幼茎褐变率比较以及幼茎褐变程度与相关生理指标的关系。结果表明，土沉香启动培养中外植体幼茎的消毒方法以７５％的乙醇浸泡３０ ｓ、０．１％的升汞浸泡５ ｍｉｎ为最佳；芽诱导的培养基以１／２ ＭＳ＋０．０１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ为最佳，诱导率为６０％；愈伤组织诱导的培养基以ＭＳ＋０．０５ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ为最佳，诱导率为８０％；上部幼茎和下部幼茎相比较，上部幼茎的褐化程度较低。幼茎褐变程度与相关生理指标的关系为：总酚含量越低，PPO活性越低，POD活性越高，褐变越严重。总酚含量下降是导致幼茎褐变的最主要原因。
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关键词 ：土沉香（Ａｑｕｉｌａｒｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）；启动培养；消毒；芽诱导；愈伤组织诱导；褐变率；生理指标
中图分类号：Ｒ２８２ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）07－1742-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.054
土沉香（Ａｑｕｉｌａｒｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）又称白木香、香材等，为瑞香科常绿乔木，其树干可分泌一种珍贵中药——沉香。沉香是中国、日本、印度、东南亚以及中东国家传统名贵药材和天然香料。土沉香是我国生产沉香的惟一植物资源。长期以来，其生态环境一直遭到破坏，再加上人们掠夺式的采掘，土沉香野生资源量在不断减少。《２０００年世界自然保护联盟受威胁植物红色名录》把土沉香列为易危植物，并指出土沉香只在云南景洪、广东、海南、广西等地可见，中国所特有［１］。为了更好地保护和开发利用土沉香，广东、云南等地对土沉香组织培养体系进行了一些研究。如叶勤法等［２］取白木香嫩枝的叶片和茎段诱导愈伤组织，产生不定芽，再进行生根诱导，形成完整植株，取得了较好的结果，增值系数较高，生根率达１００％；兰芹英等［３］对白木香成熟胚的组织培养及植株再生进行研究，筛选出了利于丛生芽和幼苗生根的培养基，其中丛生芽诱导率不高，生根率达到８５％；徐强兴等［４］对土沉香快繁技术进行研究，利用间接生根法生根效果较好，生根率达８６％，丛生芽增殖率高，且玻璃芽率低；杜勤等［５］用不同外植体、光照条件、激素对白木香愈伤组织进行了诱导，结果表明利用叶片黑暗培养有利于愈伤组织的形成；何旭君等［６］利用土沉香幼芽茎段进行组培快繁，筛选出了比较适合芽诱导的培养基及移栽基质，移栽成活率高达８２％。但土沉香的种源不同，其组织培养中的最适培养基是否有差别，本试验以广西种源的土沉香幼茎为材料，在进行启动培养研究的基础上，分析了植株不同部位的幼茎褐变率及其生理指标的关系，为在广西进行土沉香组培并提高组培成活率提供理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
试验材料为广西大学林学院苗圃实验基地１年生土沉香实生苗，试验于２０１２年１２月～２０１４年５月间进行，地点设在广西大学林学院组培实验室和植物生理实验室。
１．２ 方法
１．２．１ 外植体消毒 于干旱的晴天，从苗圃基地土沉香种子苗优选株上剪取健壮的幼嫩茎段，剪去叶片，将茎段浸泡在洗衣粉或洗洁精溶液中，用毛刷将外植体表面刷净，再用自来水冲洗约３０ ｍｉｎ。然后将土沉香茎段用７５％乙醇浸泡３０ ｓ，再利用０．１％升汞设置时间梯度对外植体幼茎进行消毒处理，获得能够对外植体幼茎彻底消毒但又不会致死的消毒方法。接种２周后观察统计污染数和污染率。
１．２．２ 启动培养芽诱导 设置植物生长素ＮＡＡ、２，４－Ｄ，细胞分裂素６－ＢＡ、ＫＴ等的浓度梯度培养基，研究不同植物激素浓度配比对土沉香茎段芽诱导率的影响。共３２个培养基，其中19个以ＭＳ为基本培养基，１３个以１／２ ＭＳ为基本培养基，每个配方培养基均３０瓶，每瓶接种１个外植体幼茎。培养条件为温度２５～２７ ℃， 每天光照１２ ｈ， 光照度为２ ０００ ｌｘ，在接种后２０ ｄ进行观察和数据统计。
１．２．３ 启动培养愈伤组织诱导 设置植物生长素２，４－Ｄ、细胞分裂素６－ＢＡ的浓度梯度培养基，研究不同植物激素浓度配比对茎段愈伤组织诱导率的影响。共７个以ＭＳ为基本培养基的配方，每个配方培养基均３０瓶，每瓶接种１个外植体幼茎。培养条件同芽诱导，在接种后１５ ｄ进行观察和数据统计。
１．２．４ 启动培养生理指标的测定 于２０１４年４月１６日采集土沉香植株不同部位（苗木０～３５ ｃｍ及３５～７０ ｃｍ）的外植体幼茎，并将其培养于ＭＳ培养基中，观察记录褐变情况，每隔５ ｄ进行一次生理指标的测定。总酚含量采用福林酚显色法测定［７］；多酚氧化酶（ＰＰＯ）活性采用邻苯二酚法测定［８］；超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性采用氮蓝四唑（Ｎｉｔｒｏ ｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＮＢＴ）比色法测定［９］；过氧化物酶（ＰＯＤ）活性采用愈创木酚法测定［１０］；抗坏血酸过氧化物酶（ＡＰＸ）活性采用紫外吸收法测定［１１］。
２ 结果与分析
２．１ 启动培养外植体消毒
在对外植体表面消毒时， 一般消毒处理时间越长，污染率会降低， 但外植体的存活率也会降低。土沉香外植体接种后１０ ｄ内发现真菌污染和细菌污染，０．１％升汞不同消毒时间对土沉香茎段污染率的影响见表１。由表１可知，经０．１％升汞消毒５ ｍｉｎ的效果最好，土沉香幼茎污染率较小，为１０．０％，并且幼茎长时间保持绿色，正常生长。
２．２ 启动培养芽诱导
土沉香外植体接种后２０ ｄ左右长出不定芽，不同激素对土沉香芽诱导的影响见表２。由表２可知，相对于以ＭＳ为基本培养基的配方，以１／２ＭＳ为基本培养基的配方土沉香芽诱导率均较高，其中以２２号处理１／２ ＭＳ＋０．０１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ的诱导率最高，达到６０．０％，这与何旭君等［６］的沉香树组织培养快速繁殖技术研究结果一致。
２．３ 启动培养愈伤组织诱导
土沉香外植体接种后１５ ｄ左右长出愈伤组织，不同激素配方对土沉香幼茎愈伤组织诱导的影响见表３。表３中的处理均以ＭＳ为基本培养基，其中以６号处理ＭＳ＋０．０５ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ的诱导率最高，达到８０％，与叶勤法等［２］的研究结果不一致。
２．４ 褐变情况及生理指标测定结果
２．４．１ 褐变情况 接种３ ｄ后土沉香外植体开始出现褐变。由图１可知，随着时间的延长，土沉香上部幼茎和下部幼茎的褐变率均逐渐增长，于５月１日结束测定时，褐变率均达到最大值，分别为７２．７％和８１．３％。土沉香上部幼茎与下部幼茎相比较，上部幼茎的褐化程度较低而下部幼茎的褐化程度较高。
２．４．２ 总酚含量的变化 由图２可知，随着时间的延长，土沉香上部幼茎和下部幼茎总酚含量均表现出逐渐下降的趋势，即总酚含量越低，褐变越严重。其中４月１６日上部幼茎和下部幼茎总酚含量均达到最大值，分别为０．１２、０．１１ ｍｇ／ｇ。结果表明，土沉香不同部位外植体幼茎相比较，褐变越严重的部位，其总酚含量越低。
２．４．３ ＰＰＯ活性的变化 由图３可知，随着时间的延长，土沉香上部幼茎和下部幼茎ＰＰＯ活性均表现出逐渐下降的趋势，即PPO活性越低，褐变越严重。其中４月１６日上部幼茎和下部幼茎ＰＰＯ活性均达到最大值，分别为１０１．５０、１０２．９６ Ｕ／（ｍｉｎ·ｇ）（ＦＷ）；５月１日上部幼茎和下部幼茎ＰＰＯ活性降到最小值，分别为３２．６、３５．０ Ｕ／（ｍｉｎ·ｇ）（ＦＷ）。试验结果表明，土沉香不同部位外植体幼茎相比较，褐变越严重的部位，其ＰＰＯ活性越高。
２．４．４ ＳＯＤ活性的变化 由图４可知，随着时间的延长，土沉香上部幼茎和下部幼茎ＳＯＤ活性均表现出先急速减低后缓慢上升的趋势，其中４月１６日上部幼茎和下部幼茎ＳＯＤ活性均达到最大值，分别为２５４．２１、２２９．５９ Ｕ／ｇ（ＦＷ）；４月２６日上部幼茎和下部幼茎ＳＯＤ活性均降到最小值，分别为５４．５０、２０．０２ Ｕ／ｇ（ＦＷ）。试验结果表明，土沉香不同部位外植体幼茎相比较，褐变越严重的部位，其ＳＯＤ活性越低。
２．４．５ ＰＯＤ活性的变化 由图５可知，随着时间的延长，土沉香上部幼茎和下部幼茎ＰＯＤ活性均表现出逐渐上升的趋势，即POD活性越高，褐变越严重。其中４月１６日上部幼茎和下部幼茎ＰＯＤ活性均为最小值，分别为２４．９８、１４．９５ Ｕ／（ｍｉｎ·ｇ）（ＦＷ）；５月１日上部幼茎和下部幼茎ＰＯＤ活性均达到最大值，分别为６２５．８１、５００．０２ Ｕ／（ｍｉｎ·ｇ）（ＦＷ）。试验结果表明，土沉香不同部位外植体幼茎相比较，褐变越严重的部位，其ＰＯＤ活性越低。
２．４．６ ＡＰＸ活性的变化 由图６可知，随着时间的延长，土沉香上部幼茎和下部幼茎ＡＰＸ活性均表现出先降后升的趋势，其中４月２１日上部幼茎和下部幼茎ＡＰＸ活性均降低到最小值，分别为３６．６４、３３．５０ Ｕ／（ｍｉｎ·ｇ）（ＦＷ）；５月１日上部幼茎和下部幼茎ＡＰＸ活性均达到最大值，分别为６５．０８、５５．０２ Ｕ／（ｍｉｎ·ｇ）（ＦＷ）。试验结果表明，土沉香不同部位外植体幼茎相比较，褐变越严重的部位，其ＡＰＸ活性越低。
３ 小结与讨论
在植物组织培养中，外植体的褐变是导致培养失败的主要原因。外植体的褐变是多种因素综合作用的结果，一般认为褐变与外植体的ＰＰＯ活性和总酚含量关系密切［１２］。本试验结果表明，土沉香启动培养中，上部幼茎和下部幼茎相比较，上部幼茎的褐化程度较低，其原因可能是苗木３５ ｃｍ以上的幼茎枝条长势较好，幼芽相对比较饱满，有利于土沉香启动培养幼芽的细胞分化，并有利于提高接种成活率。随着时间的延长，褐变程度加剧，其总酚含量和多酚氧化酶（ＰＰＯ）活性呈逐渐下降的趋势，超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性表现出先急速减低后缓慢上升的趋势，过氧化物酶（ＰＯＤ）活性表现出逐渐上升的趋势，抗坏血酸过氧化物酶（ＡＰＸ）活性表现出先降后增的趋势。
本研究结果表明，幼茎褐变率与相关生理指标的关系为：总酚含量越低，PPO活性越低，POD活性越高，褐变越严重。这与符真珠等［１３］关于牡丹组培褐变与总酚含量及相关酶活性的关系研究结果不一致。
因此，在土沉香启动培养中，提高总酚含量和ＰＰＯ活性，降低POD活性，是一种控制试管苗褐变的有效办法。
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