顾地周，沈红梅，闫中雪，袁 浩，徐鹏佳，周 繇，朱俊义，张力凡
（通化师范学院生命科学学院，吉林 通化 １３４００２）
摘要：以东北红豆杉（Ｔａｘｕｓ ｃｕｓｐｉｄａｔａ Ｓｉｅｂ． ｅｔ Ｚｕｃｃ．）果实成熟后的种子为供试材料，通过多因子交叉重复试验对影响东北红豆杉种胚发育的主要因素及其水平进行了探讨，旨在筛选并确定调控东北红豆杉种胚形态发育的主要因素及其适宜水平。结果表明，东北红豆杉种胚发育的调控方法和主要因素及其水平为以饱和碳酸钠溶液浸泡种子２０～３０ ｍｉｎ除油脂后用粗沙去除部分种皮，再用１．８０ ｍｇ／Ｌ 6-苄氨基腺嘌呤（６－ＢＡ）、２．２０ ｍｇ／Ｌ赤霉素（ＧＡ３）和０．３０ ｍｇ／Ｌ 2，4-二氯苯氧乙酸（２，４－Ｄ）混合溶液浸泡３６ ｈ，将种子与河沙（１∶３）混合，进行１５５ ｄ的变温处理，变温幅度和时间：白天温度为（２３±２） ℃，处理１０ ｈ，夜间温度为（１５±２） ℃，处理１４ ｈ，子叶胚完全分化率９８．０％，种子发芽率９５．０％以上。
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关键词 ：东北红豆杉（Ｔａｘｕｓ ｃｕｓｐｉｄａｔａ Ｓｉｅｂ． ｅｔ Ｚｕｃｃ．）；种胚；形态发育；调控技术；育苗
中图分类号：Ｓ７９１．４９ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）07－1621-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.023
东北红豆杉（Ｔａｘｕｓ ｃｕｓｐｉｄａｔａ Ｓｉｅｂ． ｅｔ Ｚｕｃｃ．）又称紫杉、赤板松，为红豆杉科红豆杉属常绿乔木，该树种在长白山区数量稀少，分布区域十分狭窄，仅在吉林省石湖自然保护区内有较大的种群面积，其他区域仅有零星分布。东北红豆杉不仅是材用植物，也是重要的药用植物，其茎、枝、叶和根可入药，主要成分含紫杉醇、紫杉碱、双萜类化合物，具有抗癌功能［１］，并有抑制糖尿病及治疗心脏病的功效。此外种子还可以榨油等，也可作东北及华北地区的绿化及造林树种。目前，东北红豆杉主要用插条扦插繁殖，种苗大多为灌木型，不适合东北红豆杉的造林，加之人们对野生资源乱采滥挖，导致野生资源受到灭绝性威胁；种子苗均为乔木型，但种子繁殖发芽率极低，种子播种后当年不萌发，２～３年后仅极少数萌发，因此，东北红豆杉大规模人工栽培、开发和利用受到极大限制。
研究［２－４］表明，在组织培养中，2，4-二氯苯氧乙酸（２，４－Ｄ）和6-苄氨基腺嘌呤（６－ＢＡ）等植物生长调节物质搭配使用可诱导植物体细胞形成胚性愈伤组织，胚性愈伤组织可进一步分化出胚胎，胚胎相当于种子中的种胚，可直接发育形成完整的植株。为此，应用植物组织培养技术中的体细胞胚胎发生发育原理对东北红豆杉种胚发育进行激素和变温处理同步调控的方法，以期筛选确定影响种胚发育的主要因素及其水平，从而解决东北红豆杉种子萌发和育苗中存在的困难，为东北红豆杉大规模人工栽培提供种子处理和育苗技术。
１ 材料与方法
１．１ 材料及处理
１０月上旬采集东北红豆杉成熟果实（紫红色），用水将种子和果肉分离后洗出成熟种子。用饱和碳酸钠溶液浸泡种子２０～３０ ｍｉｎ除油脂后，倒掉碳酸钠溶液用清水冲洗种子３次，再用粗河沙与种子混合（２∶１）后将外种皮搓掉一部分保留薄薄一层（保障种胚对水、药液的吸收）。然后将种子连同河沙用不同浓度的６－ＢＡ、赤霉素（ＧＡ３）和２，４－Ｄ混合溶液浸泡３６ ｈ，３种激素浓度初步控制在６－ＢＡ １．２０～１．７０ ｍｇ／Ｌ、ＧＡ３ １．５０～２．００ ｍｇ／Ｌ和２，４－Ｄ ０．５０～１．００ ｍｇ／Ｌ，再均匀拌入河沙（使种子与河沙比达到１∶３）后装入木槽中，覆盖塑料薄膜置于室内进行变温处理，相对湿度控制在７０％左右。
１．２ 影响东北红豆杉种胚子叶胚形态发育的主要因素及水平筛选
经过“１．１”中方法将种子浸泡装箱后开始变温处理，变温幅度和时间：白天温度为（２３±２） ℃，处理１０ ｈ，夜间温度为（１５±２） ℃，处理１４ ｈ，初步处理期限为５０～１２５ ｄ。期间每１５ ｄ取种子观察种胚发育情况，按每１００粒种子子叶胚完全分化率（即子叶胚后期）为考察对象，子叶胚完全分化率＝子叶胚完全分化数／１００×１００％。为提高东北红豆杉种胚子叶胚的完全分化率，采用均匀设计法设计试验［５，６］，选用Ｕ１２（１２４）和Ｕ８（８４）均匀表，每处理１００粒种子，重复３次取平均值。对照组采用同样数量的种子用清水浸泡３６ ｈ后仅采用变温处理（处理时间和变温幅度同上），筛选确定影响东北红豆杉种胚完全发育的６－ＢＡ、ＧＡ３、２，４－Ｄ和处理时间的适宜水平。
１．３ 播种和苗期管理
经过处理后的种子（子叶胚已完全分化）可直接均匀散播于做好的畦上，并用细土覆盖，土层约为０．４ ｃｍ，再覆盖适量腐熟落叶松松针，浇透水，等待种子发芽。种子发芽且子叶完全展开后，每隔１５ ｄ用喷壶于叶表面和背面喷施１次０．１％的磷酸二氢钾溶液，苗期可根据情况喷洒３％的代森锰锌以防止根腐病。
１．４ 数据处理与分析
通过均匀设计法进行试验设计，试验所得数据经分析处理后摸索出影响东北红豆杉种胚子叶胚完全发育主要因素的显著性，在此基础上再进一步补充试验，筛选确定影响东北红豆杉种胚完全分化率主要因素的适宜水平。均匀设计采用Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｄｅｓｉｇｎ ３．０Ｖ软件进行。
２ 结果与分析
２．１ 影响东北红豆杉种胚子叶胚形态发育的主要因素显著性初步筛选
根据“１．１”和“１．２”中方法，进行１２个水平的处理，同时开展１个水平的对照试验，试验数据（表１）经分析处理后，可得回归方程为Ｙ＝－１２．９＋２５．８ Ｘ１＋３７．９ Ｘ２－２４．３ Ｘ３＋０．０５８ Ｘ４，显著性水平α＝０．０５，复相关系数Ｒ＝０．９８８ ５，剩余标准差Ｓ＝１．４５０ ０，检验值Ｆ＝７４．７６﹥临界值Ｆ（０．０５，４，７）＝４．１２０，回归方程具有显著性，表明６－ＢＡ、ＧＡ３、２，４－Ｄ和变温处理时间均对东北红豆杉种胚子叶胚的发生影响显著。计算６－ＢＡ、ＧＡ３、２，４－Ｄ和变温处理时间对东北红豆杉种胚子叶胚发生的贡献值和贡献率可知，Ｕ１＝１６０，Ｕ１／Ｕ＝２５．３％；Ｕ２＝２４８，Ｕ２／Ｕ＝３９．３％；Ｕ３＝１４２，Ｕ３／Ｕ＝２２．５％；Ｕ４＝１３．１，Ｕ４／Ｕ＝２．０７％。
２．２ ６－ＢＡ、ＧＡ３、２，４－Ｄ浓度交叉配比和变温处理时间对东北红豆杉种胚子叶胚形态发育的影响
６－ＢＡ、ＧＡ３和变温处理时间与子叶胚发生率呈正相关，而２，４－Ｄ与子叶胚发生率呈负相关，变温处理时间对东北红豆杉子叶胚发生率的贡献虽小，但变温处理时间在东北红豆杉种胚子叶胚发生过程中同样起着不可缺少的作用，由此推测，６－ＢＡ和ＧＡ３质量浓度分别高于１．７０ ｍｇ／Ｌ和２．００ ｍｇ／Ｌ，２，４－Ｄ质量浓度低于０．５０ ｍｇ／Ｌ，变温处理时间超过１２５ ｄ时，东北红豆杉种胚子叶胚发生率可能更高。为验证此推测，又以６－ＢＡ质量浓度为１．７０、１．８０、１．９０和２．００ ｍｇ／Ｌ，ＧＡ３质量浓度为２．００、２．１０、２．２０、２．３０、２．４０和２．５０ ｍｇ／Ｌ，２，４－Ｄ质量浓度为０．５０、０．４０、０．３０、０．２０和０．１０ ｍｇ／Ｌ，变温处理时间为１２５、１４０、１５５、１７０、１８５和２００ ｄ开展８个水平的补充试验（表２），重复３次取平均值。操作过程同“１．１”和“１．２”中方法，结果发现，６－ＢＡ、ＧＡ３和２，４－Ｄ质量浓度分别为１．８０、２．２０、０．３０ ｍｇ／Ｌ，以及变温处理时间为１５５ ｄ时，初期的东北红豆杉种胚子叶胚（胚芽长度达１ ７８４ μｍ）（图１ａ）历经子叶胚中期（胚芽长度达２ ３７７ μｍ）（图１ｂ）完全发育至可萌发的子叶胚后期（胚芽长度达２ ８５０ μｍ）（图１ｃ），子叶胚完全分化率最高，达９８．０％，比表１所列１２个处理和对照的子叶胚完全分化率均高。
２．３ 播种和苗期管理
按照“１．１”和“１．２”中方法处理后的种子（子叶胚已完全分化）不再经过冷冻层积或GA3等处理可直接均匀散播于做好的畦上，并用细土覆盖，土层约为０．４ ｃｍ，再覆盖适量腐熟落叶松松针，浇透水，播种２２ ｄ后，东北红豆杉种子开始发芽（图２ａ、图２ｂ），发芽率达９５．０％以上，４５ ｄ后幼苗可长至约１０ ｃｍ（图２ｃ、图２ｄ），此时，每隔１５ ｄ用喷壶于叶表面和背面喷施１次０．１％的磷酸二氢钾溶液，苗期可根据情况喷洒３％的代森锰锌以防止根腐病。
３ 小结与讨论
由试验结果可知，东北红豆杉种子后熟的条件为：种子用饱和碳酸钠溶液浸泡２０～３０ ｍｉｎ去除油脂后，倒掉碳酸钠溶液用清水冲洗种子３次，再用粗沙磨去大部分坚硬种皮，用１．８０ ｍｇ／Ｌ的６－ＢＡ、 ２．２０ ｍｇ／Ｌ的ＧＡ３和０．３０ ｍｇ／Ｌ的２，４－Ｄ混合溶液浸泡３６ ｈ后，添加河沙使种子与河沙（１∶３）拌均后装入木槽中，覆盖塑料薄膜置于室内进行１５５ ｄ的变温处理，变温幅度和时间：白天温度为（２３±２） ℃，处理１０ ｈ，夜间温度为（１５±２） ℃，处理１４ ｈ，子叶胚完全分化率可达９８．０％。东北红豆杉种子的子叶胚可由初期历经子叶胚中期最终完全发育至可萌发的子叶胚后期。
目前，对于果实成熟后种胚未分化完全的种子处理可分为两个阶段，第一阶段为形态后熟（形态建成）阶段，这类种子大多采取变温处理促使种胚发育至可萌发的子叶胚；第二阶段为生理后熟阶段，即已形态后熟（可萌发的子叶胚）的种子进一步采取低温层积或用GA3等激素浸泡后再播种萌发。但这种时间较长、单一的变温处理控制较难，导致种胚发育缓慢、种子容易腐烂霉变，发芽率较低，这可能是单一变温处理的种子种胚发育不彻底，可萌发的子叶胚种子较少等原因所致。
在东北红豆杉种胚子叶胚形态发育过程中，６－ＢＡ、ＧＡ３、２，４－Ｄ和变温处理时间均对东北红豆杉种胚子叶胚完全分化影响显著。通过计算可知，６－ＢＡ、ＧＡ３、２，４－Ｄ和变温处理时间对东北红豆杉种胚子叶胚完全分化影响的贡献率分别是２５．３％、３９．３％、２２．５％和２．０７％，说明４个因素对东北红豆杉种胚子叶胚完全分化的贡献大小顺序为ＧＡ３、６－ＢＡ、２，４－Ｄ、变温处理时间，６－ＢＡ、ＧＡ３和２，４－Ｄ远大于变温处理时间对东北红豆杉种胚子叶胚形态发育的贡献，说明６－ＢＡ、ＧＡ３和２，４－Ｄ对种胚子叶胚形态发育起主要调控作用，这可能是６－ＢＡ、ＧＡ３和２，４－Ｄ在调控过程中导致细胞产生一定量的乙烯类或过氧化物酶、超氧化物歧化酶及淀粉酶等酶类活性发生变化［７－１０］，从而加速和促进了胚性细胞的发育进程；足够的合理变温处理对东北红豆杉子叶胚形态发育起到不可缺少的辅助调控作用，可能是种胚需要适当温变刺激才能完成乙烯类或酶类的产生和表达，也可能是东北红豆杉种子在变温处理过程中种子可溶性糖含量增加给种胚提供了利于生长的足够碳源等物质基础［１１，１２］。
通过适当浓度的６－ＢＡ、ＧＡ３和２，４－Ｄ浸泡种子后，进行合理的变温处理，种子不需要再进行生理后熟就可直接播种发芽，这可能是东北红豆杉种子在处理过程中，６－ＢＡ、ＧＡ３和２，４－Ｄ的联合作用，导致种子中积累了具有打破休眠作用的ＧＡ３，在东北红豆杉种胚子叶胚形态发育完全后，ＧＡ３在细胞分裂素（６－ＢＡ）的协同下发挥作用，从而解除了生理休眠或完成了生理后熟，这也正是细胞分裂素具有促使物质（ＧＡ３）起作用的“许可”作用［１３］。
东北红豆杉是中国珍贵的植物资源，因其育苗存在的难点，导致至今未得到大规模人工栽培和推广应用，本研究解决了东北红豆杉种胚子叶胚发育调控和育苗技术，不仅解决了种子萌发难和扦插存在生根率极低、威胁野生资源等问题，而且克服了以往报道中需要变温处理后再进行生理后熟的复杂过程［１４－１６］，具有处理东北红豆杉时间短、可操作性强、发芽率极高等优点，属集成一步后熟技术，可推广应用于东北红豆杉的工厂化育苗和规模化栽培。
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