常慧萍１， 王 丁１，夏铁骑２，邢文会１，杨 雪１， 张 红１
（１．河南教育学院生命科学系， 郑州 ４５００４６；２． 濮阳职业技术学院，河南 濮阳 ４５７０００）
摘要：研究石油降解菌ＢＳ－８（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）的生长特性及影响其产生物表面活性剂的因素。通过测定ＢＳ－８发酵液的ＯＤ６００ ｎｍ、表面张力、排油圈直径推测其生物表面活性剂的产生方式；考察了碳源、氮源、温度、ｐＨ、ＮａＣｌ浓度对其产生物表面活性剂的影响。结果表明，菌株ＢＳ－８生物的表面活性剂产生方式为生长相关型，发酵液的表面张力随菌体数量的增加而降低，排油圈直径与发酵液中表面活性剂含量呈正相关；菌株ＢＳ－８高产生物表面活性剂的碳源、氮源分别为葡萄糖、酵母膏，最适培养温度为３０ ℃，最适ｐＨ ７．０，最适ＮａＣｌ浓度为２０ ｇ／ｋｇ。
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关键词 ：生物表面活性剂；石油降解菌ＢＳ－８；生长相关型；生物学特性
中图分类号：Ｘ５３ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０７－１５６７－０３
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０７．００８
生物表面活性剂（Ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ，简称ＢＳ）是由微生物在一定条件下代谢合成的分子结构中同时存在极性亲水基和非极性疏水基，能够显著降低水溶液表面张力的一种次级代谢产物［１］。与化学合成的表面活性剂相比，具有用量少、选择性好、低毒、可生物降解等优点，被广泛应用于食品工业、化妆品工业、制药工业以及环境工程等领域。许多利用微生物修复石油污染的研究表明，生物表面活性剂起到了非常重要的作用［２］。研究发现，培养基中的营养条件（如Ｃ、Ｎ、Ｐ浓度）和培养条件（如ｐＨ、温度、离子强度、接种量、种龄等）对微生物产表面活性剂都有不同程度的影响，碳源对微生物所产表面活性剂的产量和结构有决定作用，烃类物质的存在尤其是烃链长度对培养基中微生物所产表面活性剂的浓度也会有着显著的影响［３］。所以，筛选高产生物表面活性剂的菌株及对影响代谢产物的因素研究具有极其重要的意义。课题组从长期受石油污染的土壤中筛选到一组产生物表面活性剂的菌株，对其中一株高产生物表面活性剂的菌株的生长与产表面活性剂的关系进行了研究，并对影响其产表面活性剂的因素进行了探讨，为提高生物表面活性剂的发酵产率及开发应用打下一些理论基础。
１ 材料与方法
1.1 材料
１．１．１ 菌株 菌株ＢＳ－８（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．），从长期受石油污染的土壤中筛选到［４］。
１．１．２ 培养基 ＬＢ培养基（ｇ／Ｌ）： 胰蛋白胨１０，酵母提取物５，ＮａＣｌ １０，琼脂２０；ｐＨ ７．０。
发酵培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖 ２０．０，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２．０，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５，ＫＨ２ＰＯ４ ２．０，Ｎａ２ＨＰＯ４ ２．０，ＣａＣｌ２·Ｈ２Ｏ ０．００５；ｐＨ ７．０～７．２
１．２ 方法
１．２．１ 测定方法 排油圈的测定参考王大威等［５］的方法，表面张力的测定参考曹娟等［６］的方法。
１．２．２ 菌株ＢＳ－８的生长与产表面活性剂的动态关系试验 将菌株ＢＳ－８以１０％的接种量接种到发酵培养基中，３０ ℃、１６０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养，每隔６ ｈ取样，用紫外分光光度计测定发酵液的ＯＤ６００ ｎｍ，并测定离心后的发酵上清液的表面张力及排油圈直径。
１．２．３ 影响菌株ＢＳ－８产表面活性剂的因素试验 微生物的生长需要充足的碳源、氮源等营养物质，还需要合适的培养条件如温度、pH、渗透压等。为确定菌株ＢＳ－８的最佳生长及产表面活性剂的条件，研究了碳源、氮源、温度、ｐＨ和ＮａＣｌ浓度对菌株产表面活性剂的影响。按照５％的接种量，将菌株ＢＳ－８于３０ ℃、１６０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养４８ ｈ，并测定离心后的发酵上清液的排油圈直径。具体设计见表 １。
２ 结果与分析
２．１ 菌株ＢＳ－８产表面活性剂与菌体生长的动态关系
菌株ＢＳ－８在发酵培养基中振荡培养，定时取样，测定发酵液的ＯＤ６００ ｎｍ及离心上清的表面张力和排油圈直径，结果如图１所示。有研究表明，生物表面活性剂是细菌细胞生长过程中产生的代谢产物，其产生与菌体生长有相关型和非相关型两类［７］。一定浓度范围内，发酵液中表面活性剂的含量与表面张力呈反比［８］。发酵液的表面张力反映了菌株产表面活性剂的能力。图１表明，在发酵培养基中菌株在６ ｈ时已开始产表面活性剂，６～３０ ｈ内菌体数量迅速增加，发酵液的表面张力随菌体数量的增加而降低，表面张力快速下降（从６３．２ ｍＮ／ｍ下降为３９．４ ｍＮ／ｍ）。随着菌体数量缓慢增长，表面张力持续下降但降速减慢。３０～５４ ｈ间细菌数量达到最高值，发酵液的表面张力也降至最低值３４．１ ｍＮ／ｍ。５４～７２ ｈ间，菌体数量有所下降，表面张力有所增加。
排油圈直径与发酵液中表面活性剂含量呈正相关，与表面张力呈负相关，即表面张力越大，排油圈直径越小。由图１可知，６～３０ ｈ上清液的表面张力快速下降，而排油圈直径从１１ ｍｍ增大到６２ ｍｍ，随着培养时间的增加，上清液表面张力持续下降但降速减慢，排油圈直径维持在６２ ｍｍ左右。据以上分析，推测菌株ＢＳ－８的表面活性剂产生方式为生长相关型。
２．２ 不同因素对菌株ＢＳ－８产生表面活性剂的影响
２．２．１ 菌株ＢＳ－８产表面活性剂的最适碳源 碳源是菌体生长和产生代谢产物必不可少的营养基质，充足的碳源决定了菌株产表面活性剂的产量。分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉作为发酵培养基中的碳源，经过４８ ｈ的培养，测定各发酵液的排油圈大小。从图２可知，以葡萄糖为碳源时，排油圈直径最大达到６２ ｍｍ，其他几种碳源产生的排油圈均小于以葡萄糖为碳源产生的排油圈。即葡萄糖为碳源的发酵培养液中生物表面活性剂的含量最高，所以培养液的碳源选择葡萄糖。
２．２．２ 菌株ＢＳ－８产表面活性剂的最适氮源 分别以硫酸铵、牛肉膏、酵母膏、尿素、硝酸铵作为发酵培养基中的氮源，经４８ ｈ的培养，测定发酵液的排油圈大小。图３数据表明，不同的氮源对菌株ＢＳ－８产表面活性剂的量有较大的影响。以酵母膏为氮源时，排油圈直径最大达到６６ ｍｍ，均大于其他几种氮源产生的排油圈，几种氮源的效果大小顺序为酵母膏、牛肉膏、硫酸铵、硝酸铵、尿素。
２．２．３ 菌株ＢＳ－８产表面活性剂的最适温度 菌株ＢＳ－８在不同温度下培养，发酵上清液产生的排油圈大小也不同，说明温度对菌株产表面活性剂的能力有一定的影响。由表２可知，在２０～４０ ℃的范围内菌株ＢＳ－８的排油圈直径较大，６０ ℃时仍具有产表面活性剂的能力，说明该菌株具有较广的生长温度范围。当培养温度为３０ ℃时，排油圈直径达到６７ ｍｍ。
２．２．４ 菌株ＢＳ－８产表面活性剂的最适ｐＨ 菌株ＢＳ－８接种在不同ｐＨ的培养液中，经振荡培养，其产表面活性剂的能力如表３所示。不同ｐＨ下，发酵上清液产生的排油圈大小不同，说明ｐＨ影响菌株产表面活性剂的能力。由表３可知，菌株ＢＳ－８在ｐＨ ６．０～９．０范围内排油圈直径较大。当ｐＨ为７．０时，排油圈直径最大达到６５ ｍｍ，发酵液中表面活性剂的含量最高。
２．２．５ 菌株ＢＳ－８产表面活性剂的最适ＮａＣｌ浓度 菌株ＢＳ－８在不同ＮａＣｌ浓度的发酵液中培养，其产表面活性剂的能力如表４所示。由表４可知，发酵培养基中不同浓度的ＮａＣｌ对菌株产表面活性剂的产量有较大影响，菌株ＢＳ－８在ＮａＣｌ浓度为１０～３０ ｇ／ｋｇ 的范围内均生长良好，能耐受浓度５０ ｇ／ｋｇ的ＮａＣｌ， 当ＮａＣｌ浓度为２０ ｇ／ｋｇ时，排油圈直径最大。
３ 结论与讨论
对生物表面活性剂的特性研究表明，其适用于石油工业和环境工程，因此生物表面活性剂的研究与开发逐渐成为国内外的研究热点［９］，生物表面活性剂的生产方法主要有微生物发酵法和酶催化法两种。根据微生物的种类和目标产物的不同将发酵法分为四种：生长细胞法、代谢控制的细胞生长法、休止细胞法和加入前体法［１０，１１］。目前只有少数产品走向市场，主要原因是生物表面活性剂的生产成本较高。通过选育高产菌株、改进发酵工艺及提高生物表面活性剂的产率可以降低其成本，使其走向大规模工业化生产。菌株ＢＳ－８（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）是从长期受石油污染的土壤中筛选到的高产生物表面活性剂的菌株，对其生长与产表面活性剂的关系进行了研究，并对影响其产表面活性剂的因素进行了探讨。菌株ＢＳ－８产表面活性剂与菌体生长的动态关系表明，菌株ＢＳ－８的表面活性剂产生方式为生长相关型，排油圈直径与发酵液中生物表面活性剂含量正相关，与表面张力负相关。以排油圈直径表征发酵液中生物表面活性剂的含量，不同因素影响了菌株产表面活性剂的能力，菌株ＢＳ－８高产表面活性剂碳源、氮源分别为葡萄糖、酵母膏，最适培养温度３０ ℃，最适ｐＨ ７．０，最适ＮａＣｌ浓度为２０ ｇ／ｋｇ。
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