杨亚珍ａ，查 凡ａ，果 然ａ，张建民ｂ
（长江大学，ａ．生命科学学院；ｂ．农学院，湖北 荆州 ４３４０２５）
摘要：以果园土为菌种来源，采用平板分离法得到５种酵母菌，对其进行紫外线诱变，筛选出７株酵母菌突变株，通过测定突变株的发酵性能，从中筛选出１株液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力及发酵力均较好的酵母突变株Ｎ４－４，其发酵液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力和发酵力比对照菌株分别提高了６．７％、７．５％、８．１％和３９．０％，通过单因素和正交试验确定该突变株的最佳发酵条件。结果表明，在３０ ℃、１２０ ｒ／ｍｉｎ的培养条件下，突变株最佳发酵条件为３％葡萄糖、３％（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ ５．０、３％接种量（Ｖ∶Ｖ）。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ：酵母菌；紫外线诱变；发酵条件
中图分类号：TS261.1；Q93.3 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）07－1664-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.034
酵母菌是白酒发酵过程中的一种重要微生物，白酒风味的形成与发酵过程中各种酵母菌息息相关［１］。酵母菌的主要作用是将原料糖化后的绝大部分糖类物质转化为乙醇和二氧化碳，同时生成甘油、高级醇、酯、醛等代谢产物，直接影响着白酒的色泽、香气及口感，决定着白酒的质量。酵母菌的发酵特性常常因菌株的不同而存在明显的差异［２］，野生型酵母菌在工业发酵过程中不可避免地受到胁迫条件（如乙醇毒性、高温胁迫等）的影响，最终影响到乙醇产率和白酒品质以及其经济效益。工业上常常采用紫外线诱变的方法，对酿酒酵母工业菌株进行改良来提高菌株对胁迫条件的耐受性［３］。本试验采用紫外线诱变的方法对果园土中分离到的５株酵母菌进行诱变，以期筛选出发酵力较高的突变株，为提高白酒的产量和质量提供参考。
１ 材料与方法
１．１ 材料
菌种来源：分离自陕西省周至县邵家堡村苹果园土壤中。
１．２ 试验方法
１．２．１ 酵母菌分离、纯化和菌种保藏 酵母菌的分离、纯化和菌种保藏教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献［４－６］。
１．２．２ 不同菌株发酵性能测定 将分离得到的菌株分别制成酒曲后用常压干燥法测定水分含量；采用酸碱滴定法测定酸度；采用碘量法测定液化酶活力；采用ＤＮＳ法测定糖化酶活力；采用福林－酚法测定蛋白酶活力；采用ＣＯ２失重法测定发酵力［７，８］。
１．２．３ 紫外线（ＵＶ）诱变 选取发酵性能最好的菌种接种至装有麦芽汁液体培养基的锥形瓶中，１３０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养，于２８ ℃恒温培养箱培养４８ ｈ，得到对数生长阶段的酿酒酵母菌悬液［９］。再用麦芽汁液体培养基将菌悬液稀释，使菌种的浓度达到１×１０６ 个／ｍＬ。打开紫外灯（１５ Ｗ），预照射２０ ｍｉｎ，使其功率达到稳定。取４ ｍＬ菌悬液放入直径为９ ｃｍ的无菌培养皿中，将培养皿平放在距紫外灯３０ ｃｍ（垂直距离）处的磁力搅拌器上，启动磁力搅拌器，照射０、１、２、３、４、５、6 ｍｉｎ后将菌液在黑暗中冷冻保存１～２ ｈ，然后在红灯下稀释至１×１０－６个／ｍＬ，并涂布平板，２８ ℃恒温培养４８ ｈ，计算菌株致死率，保存致死率在７５％以上的孤立菌落［１０］。
１．２．４ 优良突变株的筛选 在“1.2.3”的基础上进行筛选，筛选方法同“１．２．2”。
１．２．５ 优良突变株最优发酵条件筛选
1）pH试验：将液体培养基的初始pH分别调至3、4、5、8、9、10，接种1%的优良突变株。30 ℃、120 r/min培养24 h后，涂布平板，统计菌落数并测定培养液发酵力。
2）碳源试验：制备含3%的不同碳源（葡萄糖、果糖、麸皮、麦芽糖、甘露糖、乳糖）的培养液，接种1%的优良突变株，30 ℃、120 r/min培养24 h后，涂布平板，统计菌落数并测定培养液发酵力。
3）氮源试验：制备含2%的不同氮源［蛋白胨、黄豆粉、酵母粉、牛肉膏、NaNO3、(NH4)2SO4］的培养液，接种1%的优良突变株，30 ℃、120 r/min培养24 h后，涂布平板，统计菌落数并测定培养液发酵力。
4）接种量试验：制备100 mL液体培养基，分别接种2％、4％、6％、8％、10％的优良突变株，30 ℃、120 r/min培养24 h后，涂布平板，统计菌落数并测定培养液发酵力。
１．２．６ 正交试验 根据单因素试验结果设计正交试验，选择４因素３水平进行试验，正交试验因素和水平见表１。
２ 结果与分析
２．１ 酵母菌的分离、纯化结果
经反复分离纯化筛选出５种酵母菌，其菌落形态特征见表２。
２．２ 菌株发酵性能
将所筛选的５种酵母菌分别制成酒曲，测定其部分理化指标，结果见表３。由表３可知，酒曲Ｎ２、Ｎ４的水分含量均在１２％～１３％，酸度在１．１ ｍｍｏｌ／１００ ｇ以上，研究表明，酸度在０．９～１．３ ｍｍｏｌ／１００ ｇ的为一级酒曲，在０．６～０．９ ｍｍｏｌ／１００ ｇ的为二级酒曲［6］，因此这两种酒曲已满足一级酒曲的要求。Ｎ４号酒曲液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力均为最高，Ｎ２号酒曲次之。而Ｎ２号酒曲发酵力最大，Ｎ４次之。综合考虑各项指标，选择Ｎ４号株菌作为出发菌种进行紫外线诱变。
２．３ Ｎ４号菌株的紫外线诱变致死率
由表４可知，紫外线处理对酵母菌有较强的致死作用。诱变时间越长，致死率越高。当致死率超过７５％时常引起正突变［１０］，因此选择诱变３ ｍｉｎ致死率为９７．１％的这４株菌株（记为Ｎ４－１、Ｎ４－２、Ｎ４－３、Ｎ４－４），诱变４ ｍｉｎ致死率为９８．６％的２株菌株（记为Ｎ４－５、Ｎ４－６）和诱变５ ｍｉｎ致死率为９９．３％的１个菌株（记为Ｎ４－７）做进一步试验。
２．４ 突变株发酵性能比较
由表５可知，与对照相比，诱变４、５ ｍｉｎ所得的突变株Ｎ４－５、Ｎ４－６和Ｎ４－７发酵力均有不同程度下降，呈现负突变。而诱变时间较短的Ｎ４－２、Ｎ４－３和Ｎ４－４ ３株突变株发酵力较诱变前均有不同程度提高，其中突变株Ｎ４－４的发酵力最好，其液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力和发酵力比对照菌株分别提高了６．７％、７．５％、８．１％和３９．０％。
２．５ 优良菌株Ｎ４－４的遗传稳定性
根据突变株发酵力测定结果，对优良菌株Ｎ４－４的遗传稳定性进行分析，结果如表６所示。由表６可知，诱变后得到的优良菌株Ｎ４－４经３代传递，菌株发酵力仍保持较高水平，而且比较稳定，说明突变株已具有稳定的遗传性状。
２．６ 优良菌株Ｎ４－４的最优发酵条件研究
２．６．１ 酵母菌发酵的最适ｐＨ 由表７可知，ｐＨ对酵母菌的生长和发酵能力影响较大，ｐＨ为３～５时，菌落数和发酵力均呈增长趋势；ｐＨ为５时菌落数和发酵力均为最大，分别为２．６×１０１１ ＣＦＵ／ｍＬ和０．８６５ ｇ/（ｇ·７２ ｈ），然后随ｐＨ再增大，菌落数和发酵力均呈下降趋势。
２．６．２ 酵母菌最适碳源 由表８可知，Ｎ４－４酵母菌对不同糖类物质的利用能力差异较大。当碳源为葡萄糖时，菌落数和发酵力均达到最大，分别为６．５×１０１１ ＣＦＵ／ｍＬ、０．９１３ ｇ/（ｇ·７２ ｈ）；当碳源为乳糖时，菌落数为５．３×１０７ ＣＦＵ／ｍＬ，发酵力为０．３６３ ｇ/（ｇ·７２ ｈ），远远低于葡萄糖为碳源时的菌落数和发酵力。
２．６．３ 酵母菌最适氮源 由表９可以看出，氮源为 （ＮＨ４）２ＳＯ４时，酵母菌Ｎ４－４菌落数和发酵力均为最佳，分别为２．２×１０１１ ＣＦＵ／ｍＬ、０．６８９ ｇ/（ｇ·７２ ｈ），因此，选择（ＮＨ４）２ＳＯ４为酵母菌培养最适氮源。
２．６．４ 酵母菌最适接种量 由表１０可以看出，接种量为４％时，酵母菌Ｎ４－４菌落数和发酵力均达到最大，分别为２．２×１０１１ ＣＦＵ／ｍＬ、０．７３８ ｇ/（ｇ·７２ ｈ），当接种量大于４％时，酵母菌Ｎ４－４菌落数和发酵力随接种量的增大而降低。
２．７ 正交试验结果
由表11可知，4个因素对酵母菌N4-4发酵影响的大小次序为pH＞(NH4)2SO4＞葡萄糖＞接种量。4个因素的最佳配比为A2B2C3D1，即葡萄糖3%、pH 5.0、接种量3%、(NH4)2SO4 3%。在此种配比的发酵培养基中30 ℃培养48 h后，酵母菌N4-4发酵力可达0.978 g/（g·72 h）。
３ 讨论
本研究通过平板分离、紫外线诱变筛选出１株糖化酶活力、液化酶活力、蛋白酶活力旺盛的酵母突变株N4-4，并通过正交试验确定了该突变株的最佳发酵条件为３％葡萄糖、３％（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ ５．０、３％接种量、发酵温度３０ ℃。本研究虽然对分离的酵母菌进行了选育，使其发酵性能有了很大程度的提高，但该酵母突变株制作麸曲或大曲后，再次酿造白酒，能否提高白酒产量和品质等问题还有待进一步研究。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献：
［１］ 王秀奇，秦淑媛，高天慧，等．基础生化实验［Ｍ］．北京：高等教育出版社，１９８２．
［２］ 杨舒雯，周志江，韩 烨，等．浓香型白酒窖泥中酵母种类的研究［Ｊ］．食品工业科技，２０１１，３２（５）：１３８－１４１．
［３］ 徐日益，梁 磊，潘 琢，等．耐酒精酵母菌株的选育及其交叉耐受性的研究［Ｊ］．酿酒科技，２００７，２６（１０）：３４－３６．
［４］ 郭 霞．浓香型白酒酒糟微生物分离及发酵试验［Ｊ］．重庆师范大学学报（自然科学版），２００５，２２（１）：５０－５２．
［５］ 胡文浪．酿酒酵母筛选、分离、纯化、选育应用［Ｊ］．酿酒科技，２００２，１８（４）：３３－３４．
［６］ 张其圣，张文学，方晓璞．新型白酒糖化发酵剂的制作工艺研究［Ｊ］．中国酿造，２００６，３２（１１）：３４－３７．
［７］ 张水华．食品分析［Ｍ］．北京：中国轻工业出版社，２００６．
［８］ 熊子书．中国名优白酒酿造与研究［Ｍ］．北京：中国轻工业出版社，１９９５．
［９］ 沈 萍，范秀容，李广武．微生物学实验［Ｍ］．北京：高等教育出版社，１９９９．
［１０］ 何国庆．食品微生物学［Ｍ］．北京：中国农业大学出版社，２００２．