常菊花
（长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025）
摘要：采用刺探电位图（EPG）技术监测褐飞虱（Nilaparvata lugens Stal）对人工取食液的取食行为，参考褐飞虱取食水稻的EPG波形，对褐飞虱取食Parafilm膜下液体状物质的EPG波形进行解析，发现褐飞虱在液体饲喂模型中产生5种典型波形，分别为非刺探波形（np波）、口针刺入波形（P波）、口针在液体中移动波形（M波）、主动抽吸波形（I波）和口针在液体中的未知波形（X波）。采用饲喂模式分析褐飞虱取食不同浓度蔗糖溶液的刺吸行为，发现褐飞虱对2．50％～20．00％浓度范围的蔗糖溶液吸食时间较长，尤其是5．00％和20．00％蔗糖组的褐飞虱有一半左右的记录时间处于主动吸食状态。蔗糖溶液在用于褐飞虱EPG监测的液体饲喂模式时，推荐5．00％～20．00％作为候选人工取食液浓度。
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关键词 ：褐飞虱（Nilaparvata lugens Stal）；液体饲喂模式；蔗糖；取食行为；刺探电位图
中图分类号：S435．112＋3；S482．3 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2015）06－1374－04
DOI：10．14088/j．cnki．issn0439－8114．2015．06．024
Technique of Monitoring Feeding Behavior of Brown Planthopper
Based on Liquid Diet Model
CHANG Ju-hua
（College of Life science， Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）
Abstract： Electrical penetration graph （EPG） was used to monitor the probing and sucking behavior of brown planthopper feeding with artificial liquid diet. The corresponding EPG waveforms were identified using the EPG waveforms of brown planthopper feeding with rice plants as reference． It results showed that there were 5 typical waveforms on liquid diet model correlated with feeding behaviors including non－probe（np）， stylet penetrating into liquid （P）， stylet moving in liquid （M）， active ingestion of liquid （I） and unknown behavior of stylet in liquid （X）． The feeding behavior of brown planthopper feeding on sucrose solution of different concentrations was studied using EPG technique on the liquid diet model． The results showed that the total time of ingestion waveforms in groups of 2．50％~20．00％ sucrose solution was longer than that of the control group （in fresh water）. The brown planthopper in groups of 5．00％ and 20．00％ sucrose solutions was in active ingestion at half of the recording time． Therefore， 5．00％～20．00％ sucrose solution is recommended as the candidate diet for the EPG recording of brown planthopper feeding on the liquid diet model．
Key words：brown planthopper（Nilaparvata lugens Stal）； liquid diet model；sucrose；feeding behavior； electrical penetration graph（EPG）
收稿日期：2014－07－25
作者简介：常菊花（1982－），女，陕西榆林人，讲师，博士，主要从事农药毒理学研究，（电话）15926564507（电子信箱）Juhua1756@163．com。
褐飞虱（Nilaparvata lugens Stal）是中国及亚洲水稻的主要害虫，为典型的刺吸式昆虫，主要通过口针刺吸韧皮部汁液对水稻植株造成危害，严重时发生水稻虱烧现象。褐飞虱的为害方式与其取食行为密切相关，其在植株上的取食行为已成为农业有害昆虫研究的重要内容。
使用昆虫取食监测仪（刺探电位图技术，Electronic penetration graph，EPG）是研究刺吸式昆虫（蚜虫、飞虱、叶蝉等）在植物组织内部取食行为的一种精确、直观的方法［1－3］。通过记录刺吸式昆虫口针刺探和取食植物组织过程中产生的刺探电位波形特征，观察昆虫在植物组织内部的刺探和取食行为过程，能定量研究昆虫在植物组织内部分泌唾液和刺吸汁液等取食行为。Mclean等［4］首次报道了刺探电位图技术在豌豆蚜取食行为研究中的应用，刺探电位图技术在稻飞虱取食行为中的应用研究始于20世纪80年代。刺探电位图技术在褐飞虱取食行为中的刺吸波形所表示的生物学意义已越来越清楚［5－9］，并以此为基础进行了褐飞虱在水稻品种上的取食行为及杀虫剂、化学物质和环境因素对褐飞虱取食的影响等研究［10－13］。
由于刺吸式口器昆虫与植物的相互关系比较复杂，昆虫口针在植物体内的行为活动多样，EPG监测时波形多样且复杂，而刺吸式口器昆虫在取食人工饲料时口针行为较简单，人工饲料可以为EPG监测定性或定量研究刺吸式口器昆虫取食行为提供单一且可重复的环境［14］。本研究采用EPG监测褐飞虱对人工取食液的取食行为，参考褐飞虱取食水稻的EPG波形来解析人工取食液的EPG波形，并分析褐飞虱取食不同浓度蔗糖溶液时的刺吸行为差异，为基于液体饲喂的EPG监测技术在褐飞虱取食行为研究中的应用提供基础。
1 材料与方法
1．1 供试昆虫
采用室内长期饲养的褐飞虱为供试虫源，选取羽化1～3 d的雌成虫进行测试。采用汕优63水稻植株饲养，饲养温度为（27±1） ℃，光周期为16 h∶8 h（L∶D）。
1．2 褐飞虱取食Parafilm膜下液体的刺吸行为监测
采用四通道面板控制直流电型（DC－EPG型）昆虫电子取食监测仪进行监测。Parafilm膜封液体法，将50 mL塑料三角杯去底面，用Parafilm膜封住底面，叠至盛有溶液的另一个三角杯中，再将植物电极插入溶液，注意在膜和液面之间不要有气泡。先用二氧化碳短时间（15 s）麻醉褐飞虱雌成虫（预先饥饿2 h），迅速用导电银胶将一根细金线（直径20 μm ，长10 cm）的一端与
飞虱胸背板黏连，另一端相连至昆虫电极。接通电流，使悬挂的试虫在Parafilm膜上能自由活动，开始记录。分设清水对照组（蔗糖浓度0）和7个蔗糖浓度组，分别为1．25％、2．50％、5．00％、10．00％、20．00％、40．00％和60．00％。每个处理10次以上有效重复，每次记录重复用不同的昆虫个体和溶液情况，记录时间6 h。所有记录均在室内进行，温度为（26±1） ℃，相对湿度为70％±5％，光照条件为持续光照。
1．3 数据统计分析 采用SAS软件的PROC MEANS程序算出试验数据的平均值和标准差，用PROC GLM程序采用新复极差法检验处理间差异显著性。
2 结果与分析
2．1 褐飞虱取食Parafilm膜下液体的EPG波形
相对褐飞虱取食水稻植株的EPG波形而言［7］，褐飞虱取食Parafilm膜下液体状物质的EPG波形比较简单（图1），出现了几种典型波形。
np波：非刺探波形。褐飞虱口针未刺入膜，这段时间的电压一般维持在0基线，有时会因为昆虫的活动而出现在基线上下呈不规律的脉冲波形，如在400 s左右出现的脉冲波形（图1A）。褐飞虱取食液体的np波形与取食水稻植株的np波形相似。
P波：开始刺探波形。即口针刺破Parafilm膜的过程，此时电压瞬时出现变化（图1B）。该波形与取食水稻植株的N1波形基本一致，区别在于褐飞虱取食水稻植株的N1波形要比取食液体的P波形复杂，因为口针刺透Parafilm膜比刺破植物表皮要简单得多。
M波：口针在液体中移动波形。此时没有吸取液体，波形无规律（图1B）。该波形与褐飞虱取食水稻植株的N2波形相似，不同的是M波形较简单且持续时间很短。
I波：持续吸食波形。波形有规律，波频一般为5～6 Hz，波幅较大（图1C）。该波形与褐飞虱取食水稻植株的N5波形相似，都属于口针主动吸食过程。
X波：未知波形。该波形不是每次记录都出现，若出现往往是在较长时间的I波形之后。从I波形至X波形电压瞬间下降，由波峰和平坦波线交替组成（图1D）。波峰间隔随时间延长而变大，刚开始时每6～7 s就会出现一波峰，往后波峰间隔有时会达到50～60 s。
2．2 褐飞虱取食不同浓度蔗糖溶液的刺吸行为
EPG监测褐飞虱雌成虫对Parafilm膜下清水和7个浓度蔗糖溶液的刺探和吸食行为，对监测结果（表1）进行分析（表2）。无论是清水还是蔗糖溶液，褐飞虱取食都出现了“2．1”所述的几种典型波形。表1列出在不同液体介质情况下褐飞虱取食波形的主要特征。
np波总持续时间：即非刺探总时间。浓度为2．50％、5．00％和20．00％蔗糖组的np波总持续时间显著小于清水组，1．25％、10．00％、40．00％和60．00％蔗糖组的np波总持续时间与清水组相当。
P波出现次数：即记录期间口针刺入次数。1．25％～20．00％蔗糖浓度范围内，刺入次数与清水组相当，40．00％和60．00％蔗糖组口针刺入次数显著增加。
M波总持续时间：M波为口针在液体内但是尚未吸取液体时的表征，通常比较短暂。1．25％～20．00％蔗糖浓度范围内，该值与清水组相当，40．00％和60．00％蔗糖组M波总持续时间显著增加。该值在不同蔗糖浓度间有差异，表现出与口针刺入次数、蔗糖浓度相关联。
I波总持续时间：即褐飞虱主动抽吸液体过程的总时间。1．25％、40．00％和60．00％蔗糖组的褐飞虱吸食时间与清水组相当，在蔗糖浓度5．00％～20．00％范围内的吸食时间明显多于清水。图2直观显示了不同浓度蔗糖溶液I波形总持续时间在总监测时间中的占比，5．00％和20．00％蔗糖组的褐飞虱有一半左右的记录时间处于主动吸食状态。
I波出现次数：即褐飞虱主动抽吸液体的次数。随着蔗糖浓度的增加，I波出现次数有增加趋势。
X波总持续时间：X波为跟随I波之后出现的未知波形。该值在不同浓度间有显著差异，40．00％和60．00％蔗糖组的X波持续间短，1．25％蔗糖组的X波时间长。试验中该波形在不同重复间出现很大差异，如20．00％蔗糖组10次有效重复中仅1次记录中出现X波形，而2．50％蔗糖组15次有效重复中有10次记录中出现X波形。X波形的出现似乎与I波形持续时间有关，但是尚未发现其具有明显的规律性。
对褐飞虱雌成虫在Parafilm膜下液体的刺吸波形进行了解析，并通过EPG监测，发现褐飞虱成虫对2．50％～20．00％浓度范围的蔗糖溶液取食时间较长。
3 小结与讨论
结合液体饲喂的EPG监测技术已在多种昆虫研究中应用［15－17］。金亮等［13］为研究植物源化合物对褐飞虱取食行为的影响，采用EPG监测了褐飞虱口针对液态人工饲料的刺探行为，定义了5种波形，分别为N1波、N2波、N3波、E波以及非刺探波np波。其中np波、N1波、N2波和E波与本研究的np波、P波、M波和I波是基本一致的，但本研究没有解析到N3波形，金亮等没有解析到X波形。N1波、N2波和N3波的命名源自褐飞虱取食水稻植株的波形［6］，N3波即褐飞虱口针刺入筛管的过程，因为水稻韧皮部外围有厚壁细胞，筛管旁还有伴胞，所以褐飞虱口针在进入筛管吸取汁液之前要穿透厚壁细胞和伴胞，会出现波幅很大的周期性波峰。取食Parafilm膜下液体时没有这种穿透过程，也应该没有N3波形，金亮等［13］观测到的N3波根据其提供的波形图来看，应该属于N2波。本研究中的X未知波形与Trebicki等［16］所描述的南斑叶蝉（Orosius orientalis）取食液态饲料的O3波形极其相似。南斑叶蝉的O3波形通常跟随在O2波形（在木质部内主动抽吸波形）之后出现，且其特征与本研究中的X波形相近，均由间断出现的尖峰和平坦起伏的信号组合而成，而且波峰的频率很小（0．02～0．05 Hz），O3波形也是随机出现，其出现频率明显要小于O2，这些与本研究中的X波形基本一致。相似的波形也在另一种叶蝉Cicadulina mbila的研究中出现［16］，但该种波形的刺探属性和口针位置尚不清楚。褐飞虱取食液态人工饲料时X波形的生物学意义有待进一步研究。X波形不经常出现，而且其出现的持续时间和次数不成规律，不会过多影响到采用液体饲喂模式进行监测褐飞虱取食行为的应用研究。
对于液体饲喂模式中的液体物质及其浓度的选择［6，17］，简单的蔗糖饲料因其单一方便，且能基本满足短期内昆虫的营养需要，可以用于短期的观测试验（如以EPG记录为目的的研究）。如果长期饲养或以观测存活率为目的的研究就需要用较高营养成分要求的饲料来替代单一的蔗糖。对于EPG研究中蔗糖溶液浓度的选择应根据昆虫种类的不同而有所差异。已有采用生测方法观察褐飞虱对不同浓度蔗糖摄取量的报道［18］，但鲜见在EPG研究中褐飞虱对不同浓度蔗糖的取食反应的报道。本研究监测发现褐飞虱对5．00％～20．00％的蔗糖溶液取食时间最长，这与文献［18］报道的褐飞虱对20．00％蔗糖溶液摄取量最大的结果基本对应。因此用于研究褐飞虱取食行为的液体饲喂可以采用5．00％～20．00％的蔗糖溶液作为液体饲料。
由于刺吸式口器昆虫与植物相互关系复杂，昆虫口针对植物的行为活动多样，EPG监测时波形多样且复杂，而刺吸式口器昆虫在取食人工饲料时口针行为较简单，取食人工饲料的EPG监测可以为定性或定量研究刺吸式口器昆虫取食行为提供单一且可重复的环境［14］。本研究采用EPG监测褐飞虱对人工取食液的取食行为，参考褐飞虱取食水稻的EPG波形来解析人工取食液的EPG波形，并分析褐飞虱取食不同浓度蔗糖的刺吸行为，为基于液体饲喂的EPG监测技术在褐飞虱取食行为研究上的应用提供基础。根据不同研究目的，液体饲喂的EPG记录时间可以有所不同。由于没有植物表面复杂的生物和化学等刺激因素，褐飞虱在人工液体饲喂条件下适应和刺探尝试要耗费更长的时间，根据试验观察，6 h以上的记录时间对于液体饲喂的褐飞虱是合适的。
使用液态人工饲料装置与使用活体植株相比有更多的优势，取食液结构均一、简单，因而刺探波形种类较少，波形识别更简单可靠，避免了植物个体差异所带来的影响，能够更直接地反映刺吸昆虫取食行为。由于蔗糖溶液中添加生物活性物质能够方便地研究单一物质的作用，因此利用液体饲喂的EPG监测技术评价生物活性物质对刺吸式口器昆虫的影响已经成为生物活性物质作用研究中比较有效的方法。对褐飞虱在液体饲喂模式下的取食行为监测可为褐飞虱取食行为研究提供候选的试验模式，该模式可以广泛用于研究杀虫剂、其他化学物质、植物次生代谢物质以及环境因素等对褐飞虱取食行为的影响等方面。
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