汪 琢1，赵佳莹1，廖 林1，陆俊霖1，杨玉红2
（1．沈阳工学院生命工程学院，辽宁 抚顺 113122；2．沈阳农业大学生物科学技术学院，沈阳 110866）
摘要：为了优化枸杞（Lycium chinense）中多糖的提
收稿日期：2014－12－16
基金项目：辽宁省大学生创新训练项目；辽宁省高等学校科学研究一般项目（L2014565）
作者简介：汪 琢（1984－），女，辽宁沈阳人，讲师，硕士，主要从事植物活性小分子的有效成分及其活性研究，（电话）18641349852
（电子信箱）wangzhuo＿7@126．com；通信作者，杨玉红（1973－），女，辽宁庄河人，教授，博士，主要从事微生物工程方面的研究，
（电话）18809857395（电子信箱）401175060@qq．com。
枸杞（Lycium chinense）为茄科（Solanaceae）植物，是落叶小灌木，可食用及药用的成熟果实被称为枸杞或枸杞子。枸杞在全国各地均有野生，以宁夏、河北、甘肃及云南等地较多。宁夏产的皮薄肉厚，色泽艳红，质量优良，久负盛名。枸杞是我国传统的出口食品之一，远销港澳、东南亚、西欧及北美等地区和国家。枸杞的开发应用，主要在于对枸杞子中枸杞多糖的开发，枸杞多糖是枸杞中主要有效成分之一，是从枸杞中提取而得的一种水溶性多糖。它是一种非特异性免疫增强剂，具有增强免疫力、抗癌、抗氧化、防衰老、增加造血功能、防止遗传损伤等作用［1－5］。目前已确定该多糖系蛋白多糖，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等6种单糖成分组成。经研究表明，枸杞多糖是枸杞子调节免疫、延缓衰老的主要活性成分，可改善老年人易疲劳、食欲不振和视力模糊等症状，并具有降血脂、抗脂肪肝、抗衰老等作用［6－10］。所以枸杞多糖的开发无论在医药行业还是在食品行业都显得尤为重要［11］。枸杞多糖可作为第三代功能性食品的功能因子，有很好的开发前景。目前对枸杞多糖的研究主要集中在枸杞多糖的结构、药理作用等方面，对枸杞多糖的生产工艺报道却很少。本试验对影响枸杞多糖的提取因素进行了较为系统的研究，优化了提取条件，旨在为其工业化生产或其相关产品的开发提供依据。
1 材料与方法
1．1 材料与设备
新鲜枸杞采集于辽宁省抚顺市枸杞种植基地，干燥粉碎后阴凉处保存。乙醇、氢氧化钠、浓硫酸、苯酚、石油醚等均为分析纯。721G型可见光分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；TDL－40B型低速台式大容量离心机：上海安亭科学仪器厂；JD100－3 型电子天平：沈阳龙腾电子有限公司；SHZ－D（Ⅲ） 型循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；RE－52A型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；GFL－70型电热鼓风干燥箱：天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；HH－6型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；FW－100型高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；MM720KG1－PW型微波炉：广东美的厨房电器制造有限公司。
1．2 试验方法
1．2．1 工艺路线 枸杞→烘干粉碎→脱脂除蛋白 →浸提→离心→取上清液减压浓缩→乙醇沉淀→ 离心→取沉淀干燥测干重→复溶→定容→测多糖提取率。
1．2．2 多糖含量的测定方法
1）质量比法。把烘干得到的枸杞粗多糖精确称量，再根据样品重量，按照下式计算出多糖提取率。
提取率＝m/M×100％
式中，m－枸杞粗多糖质量（g）；M－样品总质量（g）。
2）硫酸－苯酚法。把烘干得到的枸杞粗多糖加去离子水溶解，再转入容量瓶中定容，以葡萄糖为标准品绘制标准曲线，将定容后的枸杞多糖溶液、苯酚溶液、浓H2SO4依次按比例加入，静置10 min后振荡，冷却后在波长490 nm下测吸光度，根据标准曲线，按照下式计算出多糖提取率。
提取率＝P·V·F/m×100％
式中，P－供试溶液中葡萄糖的浓度（mg/mL）；V－供试溶液的总体积（mL）；m－样品总质量（g）；F－换算因子。
1．2．3 单因素试验 称取枸杞样品5份，每份均为10 g，考察料液比（g∶mL，下同）分别为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35；浸提温度分别为60、70、80、90、100 ℃；浸提时间分别为1、2、3、4、5 h；浸提pH分别为5、7、9、11、13；浸提次数分别为1、2、3、4；加3倍95％乙醇沉淀时间分别为2、4、6、8 h；醇沉时乙醇加入量分别为原液的1、2、3、4倍时测定多糖提取率。
1．2．4 预处理方法选择 称取枸杞样品5份， 每份均为10 g， 按料液比为1∶30，pH为7，水提温度为90 ℃，用氢氧化钠调节pH为11，再分别用微波和超声波辅助预处理30 min，提取2 h，提取2次，合并提取液，加入3倍95％乙醇沉淀6 h，测定多糖提取率。
1．2．5 优化试验 根据单因素的试验结果，再以料液比、浸提温度、浸提时间、浸提pH为影响因素，做4因素3水平的正交试验，以多糖提取率为测量指标。因素与水平见表1。
1．2．6 枸杞多糖抗氧化试验
1） 枸杞多糖抗脂质过氧化试验。取1 mL大豆卵磷脂溶液、1 mL 0．4 mol/L 的FeSO4 溶液、1 mL 异嗪皮啶溶液依次加入试管中，混匀。于37 ℃避光水浴60 min，加入2 mL TCA－TBA盐酸 混合液（15 g TCA、0．37 g TBA、2．1 mL 浓盐酸，定容至100 mL），90～100 ℃水浴15 min，迅速冷却，以3 000 r/min 离心10 min， 以去离子水为阴性对照，取上清液在535 nm波长处测定吸光度（As）［8］。抑制率计算公式如下：
抑制率＝（Ac－As）/Ac×100％
式中，As为样品的吸光度；Ac为不含样品的吸光度。
2）枸杞多糖清除超氧阴离子自由基试验。用邻苯三酚自氧化法测定清除超氧阴离子自由基的能力。取4．5 mL 50 mmol/L Tris－HCl缓冲液（pH 8．2），4．2 mL去离子水，混匀后于25 ℃水浴中保温20 min，取出后立即加入0．3 mL 3 mmol/L邻苯三酚（以10 mmol/L HCl配制，25 ℃水浴预热），迅速混匀后立即倒入比色皿，（注：空白管以10 mmol/L HCl代替3 mmol/L邻苯三酚）在319 nm波长下测定吸光度Ai。加入不同浓度的样品，再按上述方法依次加入其他试剂，用去离子水定容至1 mL，进行测量，按下面公式计算试液清除率。以相同浓度的维生素C为阳性对照，每个样品重复测定3次。清除率计算公式［11］为：
P＝（Ac－Ai）/Ac×100％
式中，Ai为加入样品的吸光度；Ac为对照的吸光度。
2 结果与分析
2．1 单因素试验结果
2．1．1 料液比 不同料液比对多糖提取率的影响结果见图1。由图1分析可知，随着溶剂的增加，多糖提取率增加。但料液比由1∶30降低到1∶35时，多糖提取率的增加幅度不大，同时考虑到水量过大，多糖浓度被稀释，反而加大后续过程的难度，增加能耗，因此初步确定料液比为1∶30较好。
2．1．2 浸提温度 不同浸提温度对多糖提取率的影响结果见图2。由图2分析可知，在60～70 ℃多糖提取率明显增大，之后也有所增加，但增加缓慢，为了节约资源，故认为浸提温度为90 ℃提取效果最好。
2．1．3 浸提时间 不同浸提时间对多糖提取率的影响结果见图3。由图3分析可知，浸提时间在1～2 h内对多糖提取率的影响较大，之后随着提取时间的延长，多糖提取率几乎不再增加，故认为浸提时间为2 h时提取效果最好。
2．1．4 浸提pH 不同pH对多糖提取率的影响结果见图4。由图4分析可知，不同的浸提pH对多糖提取率影响较大，随着pH的增加，多糖提取率显著增加，但增加到11时趋于平稳，故认为当pH 11时提取效果最好。
2．1．5 浸提次数 不同浸提次数对多糖提取率的影响结果见图5。由图5分析可知，提取次数为1～2时对多糖提取率的影响较大，之后随着提取次数的增加，多糖提取率不再增加，故认为提取次数为2时提取效果最好。
2．1．6 醇沉时间 不同醇沉时间对多糖提取率的影响结果见图6。由图6分析可知，不同的醇沉时间对多糖提取率影响较大，随着醇沉时间的延长，多糖提取率逐渐增加，直到醇沉6 h时趋于平稳，故认为当醇沉时间为6 h时提取效果最好。
2．1．7 醇沉时乙醇的加入量 醇沉时不同乙醇的加入量对多糖提取率的影响结果见图7。由图7分析可知，醇沉时不同的乙醇加入量对多糖提取率影响较大，随着乙醇的增加，多糖提取率逐渐增加，直到加入3倍原液的乙醇时趋于平稳，故认为当醇沉时加入3倍原液的乙醇提取效果最好。
2．1．8 辅助方法 不同的辅助提取方法对多糖提取率的影响结果见图8。由图8可知，超声波辅助提取可以提高多糖提取率。微波提取主要是利用微波辐射透过提取剂到达物料的内部细胞，细胞内的水分子等极性物质吸收微波能产生大量的热，使细胞内的温度迅速升高，水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，表面出现裂纹，使得胞外溶剂进入细胞内，溶解并释放出胞内多糖物质。而超声波通过其机械效应、空化效应、热效应和许多次级效应，如乳化、扩散、击碎、化学效应等极大限度地使物料细胞破碎，使其胞内物质几乎全部溶出，这样就使得提取率大大增加。
2．2 优化试验结果
通过单因素试验的筛选，可知不同料液比、浸提温度、浸提时间、浸提pH对枸杞多糖提取率有显著影响。为更进一步得出提取的最优条件，以这4个单因素选3个水平，以提取率为考察指标，采用L9（34）正交试验，结果与分析见表2。从表2可以看出，影响提取率的4个因素顺序为浸提pH＞浸提温度＞浸提时间＞料液比。由极差分析得出，枸杞多糖提取工艺最佳组合为A2B2C3D2，即浸提温度90 ℃，浸提时间3 h，料液比1∶35，pH 11。方差分析结果表明，枸杞多糖提取工艺优化因素对提取率有显著影响，但没有极显著影响。按以上正交试验分析得到的最优的条件为浸提温度90 ℃，浸提时间3 h，料液比1∶35，pH 11进行3组平行试验，得到的枸杞多糖提取率为18．56％。
2．3 枸杞多糖抗氧化试验结果
2．3．1 枸杞多糖抗脂质过氧化试验结果 卵磷脂可被·OH氧化损伤产生丙二醛（MDA）类似物，硫代巴比妥酸（TBA）可与MDA类似物反应生成粉红色物质，该物质在532 nm处有最大光吸收。通过测定加有枸杞多糖的待测液在532 nm的吸光度，即可检测枸杞多糖的抗脂质过氧化能力。结果表明，枸杞多糖对脂质过氧化具有一定的抑制作用。在浓度为1 mg/mL时，抑制率为20．15％，其抑制作用与0．2 mg/mL维生素C一致。
2．3．2 枸杞多糖清除超氧阴离子自由基作用 不同浓度枸杞多糖对超氧阴离子自由基的清除作用见图9。由图9可知，不同浓度的枸杞多糖具有一定的清除超氧阴离子自由基的能力，并随着浓度的增加，清除率不断提高。当阳性对照维生素C的浓度为0．2 mg/mL的时候，对超氧阴离子自由基的清除率可以达到75．16％，与维生素C相比，枸杞多糖清除超氧阴离子自由基的能力不及维生素C，但也具有一定的清除能力。
3 小结与讨论
通过正交试验方法确定了从枸杞中提取多糖的最佳工艺为料液比1∶35、温度90 ℃、pH 11，浸提3 h、提取2次，合并提取液，加3倍95％乙醇沉淀6 h时，多糖的提取率为18．56％；枸杞多糖的抗脂质过氧化能力试验表明，枸杞多糖对脂质过氧化具有一定的抑制作用，并且对超氧阴离子自由基具有一定的清除能力，并随着浓度的增加，清除率不断提高。目前，枸杞产业已进入多元化发展轨道，在对枸杞的诸多开发应用中，枸杞多糖的开发受到人们的高度关注，无论是其药用价值还是保健品的开发。本试验对枸杞多糖的提取条件进行优化并对其抗氧化活性进行研究，可对我国进一步研究枸杞资源提供理论参考。
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