李长春，姚国新，李国元，戴余军
（湖北工程学院/特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，湖北 孝感 432000）
摘要： 研究利用乙醇提取荷叶中的总多酚，探索乙醇体积分数、提取温度、提取时间、提取pH、提取次数以及料液比对荷叶总多酚提取率的影响，并在单因素试验的基础上进行正交优化，最终确定其优化提取条件为乙醇体积分数75％，提取温度75 ℃，提取时间100 min，提取pH为5，提取2次，料液比为1∶40（g∶mL）。在此条件下，荷叶总多酚的提取率可达2．842％。
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关键词 ：荷叶；总多酚；乙醇；正交试验
中图分类号：R284．2 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2015）06－1452－03
DOI：10．14088/j．cnki．issn0439－8114．2015．06．043
Optimizing Technologies of Extracting Polyphenols from Lotus Leaves
with Orthogonal Method
LI Chang－chun， YAO Guo－xin， LI Guo－yuan， DAI Yu－jun
（Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables of Hubei Province/
Hubei Engineering University， Xiaogan 432000， Hubei， China）
Abstract： The extraction of total polyphenol from lotus leaves by water bath heating method was optimized with single factor and orthogonal experiment． Variables including levels of alcohol， temperature， extraction duration， pH， times and material－solvent ratio were identified by a first set of single factor experiments． The optimal conditions were 75％ alcohol， 75 ℃， 100 min， pH 5， extracting twice， and material－solvent ratio 1∶40（W/V）. Under these conditions， the extraction rate of polyphenol from lotus leaf reached 2．842％．
Key words： lotus leaf； total polyphenols； ethanol； orthogonal design
收稿日期：2014－07－25
基金项目：湖北省科技计划项目（2012DCB04001）；特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室开放项目（2013K06）；
湖北工程学院科研项目（z2013002）
作者简介：李长春（1976－），男，湖北广水人，讲师，硕士，主要从事农业生物技术研究，（电话）13886398675（电子信箱）lcc386@163．com；
通信作者，戴余军（1972－），女，湖北天门人，副教授，硕士，主要从事生物化学及天然产物提取的教学与研究，（电子信箱）dyj5925@sina．com。
多酚是指广泛存在于植物体内的多羟基酚类化合物的总称，在植物体的叶片、果实、皮和根中含量较高［1，2］。多酚类物质除具有生物抗氧化性、抗衰老功能外，还可以降血脂、清暑利湿、促进肠胃消化、增强人体免疫力、抑制细菌与癌细胞生长等作用，可广泛用于医药、保健、食品、化工等领域［3－6］。随着天然产物开发的逐渐兴起，植物多酚成为当前研究的热点，目前关于茶叶［7］、葡萄皮［8］等植物多酚的提取与功能研究有较多的报道。莲（Nelumbo nucifera）属睡莲科莲属，是一种重要的经济作物，在中国大量种植，其叶片多酚含量较高，但莲藕采收后荷叶多被废弃［9］。本研究通过单因素试验和正交试验对荷叶总多酚提取工艺进行了优化，以期获得较好的工艺条件，为更好地促进莲资源的开发利用提供依据。
1 材料与方法
1．1 材料与仪器
荷叶（武植2号）采自湖北省孝感市；福林酚（上海荔达生物科技有限公司）、没食子酸（天津市红岩化学试剂厂）、Na2CO3等试剂均为分析纯。
101A－3型干燥箱（上海市实验仪器总厂）；FW135型中草药粉碎机（天津市泰斯仪器有限公司）；HHS21－6型电热恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂）；DL－5－B型离心机（上海安亭科技仪器厂）；HSZ－IID型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；RE－52CS型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；722S型可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）。
1．2 试验方法
1．2．1 检测波长的确定 精确吸取100 mg/L的标准没食子酸溶液0．2 mL加入1 mL的福林酚试剂，摇匀，静置5 min，加入10％碳酸钠溶液，然后用去离子水定容至10 mL，在室温下避光放置2 h，在分光光度计下进行500～900 nm的全波长扫描，确定最大吸收波长。
1．2．2 标准曲线的绘制 精确吸取30、60、90、120、150 μg/mL的没食子酸1 mL于10 mL试管中，分别加入3 mL福林酚试剂，摇匀，静置5 min，加入10％碳酸钠溶液，摇匀，室温避光放置2 h，用60％的乙醇定容至10 mL，以空白为对照在最大波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标，得到标准曲线，其回归方程为Y＝0．045 5X＋0．066（R2＝0．995 6）。
1．2．3 工艺流程 新鲜荷叶洗净沥干→60 ℃烘干→过60目筛→准确称取荷叶干粉1 g，加入一定体积和体积分数的乙醇溶液，调pH→恒温水浴，重复提取→离心（5 000 r/min离心20 min） →收集上清液→浓缩。
1．2．4 单因素试验 分别考察乙醇体积分数（30％、45％、60％、75％、90％）、提取温度（30、45、60、75、90 ℃）、pH（3．5、4．0、4．5、5．0、5．5）、提取时间（20、40、60、80、100 min）、料液比（g∶mL，下同）（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、提取次数（1、2、3、4）等因素对提取效果的影响。
1．2．5 正交试验 根据单因素试验结果，以乙醇体积分数、提取温度、提取时间、提取次数为因素，进行4因素3水平正交试验，优化提取工艺。
1．2．6 总多酚含量的测定 准确称取荷叶干粉1 g放入250 mL的三角瓶中，按方案提取后定容至100 mL。然后按“1．2．2”的方法测定吸光度，重复测定3次，取平均值计算总多酚的含量，并计算总多酚提取率。
总多酚提取率＝总多酚的含量/荷叶粉的质量×100％
所有数据均用DPS v 7．05版软件进行处理。
2 结果与分析
2．1 最大吸收波长的确定
在500～900 nm波长扫描同一浓度的没食子酸标准溶液，得到没食子酸溶液的吸收光谱在768．5 nm处有最大吸收峰，所以选定768．5 nm为最大吸收波长。
2．2 单因素试验结果
2．2．1 乙醇体积分数对荷叶总多酚吸光度的影响
由表1可知，乙醇体积分数对荷叶总多酚的提取有显著影响。在一定范围内随着乙醇体积分数的增加，荷叶总多酚的吸光度增加明显，但是当乙醇的体积分数达到75％以后，继续增加乙醇体积分数，荷叶总多酚的吸光度有所下降。所以在正交试验中，乙醇体积分数选择75％左右为宜。
2．2．2 提取温度对荷叶总多酚吸光度的影响 由表2可知，提取温度对荷叶总多酚吸光度影响很大。在一定的范围内，随着提取温度的升高，荷叶总多酚吸光度的增加明显，尤其是当温度从60 ℃上升到75 ℃的时候，同一个温度梯度吸光度增加的最多。当温度超过75 ℃的时候，再增加温度荷叶总多酚的吸光度反而有所下降。
2．2．3 pH对荷叶总多酚吸光度的影响 由表3可知，pH对荷叶总多酚的提取有较大的影响。在设定的pH范围内，随着pH的增加，吸光度也逐渐增加，当pH为5．0时，吸光度达到最大，进一步增加pH，荷叶总多酚吸光度反而有所下降。
2．2．4 提取时间对荷叶总多酚吸光度的影响 由表4可知，提取时间对荷叶总多酚吸光度的提取有着显著地影响。在设置的时间范围内，随着时间的增加，溶剂与荷叶粉作用的时间变长，吸光度增加，当作用时间达到100 min时吸光度最大。
2．2．5 料液比对荷叶总多酚吸光度的影响 由表5可知，料液比对荷叶总多酚的提取有着显著的影响。随着溶剂量的加大，荷叶总多酚的吸光度显著增加，但是较其他因素来看，吸光度增加的幅度不大。当料液比为1∶40时，溶液吸光度达到最大，继续增加溶剂的体积，总多酚的吸光度反而有所下降。
2．2．6 提取次数对荷叶总多酚吸光度的影响 由表6可知，提取次数对荷叶总多酚的影响显著。在设置的提取次数范围内，随着提取次数的增加，吸光度显著增加，提取3次和提取4次，吸光度无显著差异。为了不造成资源的浪费和节约成本，选取提取次数以不超过3次为宜。
2．3 正交试验结果
从上述单因素的结果可以看出，乙醇体积分数、提取温度、提取时间、提取次数对荷叶总多酚的提取影响更大，考虑到因素之间可能存在有交互作用，因此在pH为5．0、料液比为1∶40的条件下，选取这4个因素按照L9（34）正交设计进行正交试验。以荷叶总多酚提取率为指标，因素与水平见表7，正交试验结果见表8。
由表8中的k值分析得到最佳组合为A2B2C3D2，即乙醇体积分数为75％、提取温度为75 ℃、提取时间为100 min、提取2次。由极差分析可知，各因素对荷叶总多酚提取率影响的大小依次为提取次数、提取时间、乙醇体积分数、提取温度。
由于正交试验优化得到的最佳组合与表8中提取率最高的试验组合不一致，所以需要进行对比验证试验，试验重复3次。在组合A2B2C3D2的条件下，荷叶总多酚的平均提取率为2．842％，比试验组合A3B1C3D2的提取效果更好，且其相对偏差RSD为0．000 6＜0．01。因此，通过正交试验优化的最佳工艺条件合理，提取率高且具有良好的稳定性。
3 小结
本研究通过单因素试验探索了乙醇体积分数、提取温度、提取时间、提取次数、pH以及料液比对荷叶总多酚提取率的影响。结果表明，乙醇体积分数、提取温度、提取时间、提取次数对荷叶总多酚提取率的影响相比其他两个因素更为显著。
正交试验结果表明，提取温度、提取时间、提取次数、乙醇体积分数4个因素对荷叶总多酚提取率均有极显著影响，其影响程度依次为提取次数＞提取时间＞乙醇体积分数＞提取温度；优化得到最佳提取工艺条件为乙醇体积分数75％、提取温度75 ℃、提取时间100 min、提取2次，在此试验条件下，荷叶总多酚的提取率为2．842％，达到了较高的提取水平。
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参考文献：
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