王冬冬，陈雪红，曹冬梅，李 萌，王昌涛
（北京工商大学理学院生物技术系/北京市植物资源研究开发重点实验室，北京 100048）
摘要：采用乙醇和微生物的方法对马齿苋（Portulaca oleracea L．）和银杏（Ginkgo biloba L．）叶进行黄酮的提取，并测定粗提液对DPPH自由基的清除作用。结果表明，乙醇提取马齿苋和银杏叶黄酮的提取率分别为2．00％和4．37％，微生物提取马齿苋和银杏叶黄酮的提取率分别为2．07％和4．84％。马齿苋和银杏叶微生物提取液对DPPH自由基的清除作用在相同的稀释倍数下高于乙醇提取液，表明微生物提取植物中黄酮具有一定的可行性和优越性。
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关键词 ：马齿苋（Portulaca oleracea L．）；银杏（Ginkgo biloba L．）叶；黄酮；微生物；DPPH自由基
中图分类号：TQ234．2；R284．2 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2015）06－1455－03
DOI：10．14088/j．cnki．issn0439－8114．2015．06．044
Microbiological Method of Extracting the Flavonoids from Purslane and Ginkgo Biloba and Analyses of Its Antioxidant Activity
WANG Dong－dong，CHEN Xue－hong，CAO Dong－mei，LI Meng，WANG Chang－tao
（School of sciences/Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development，
Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）
Abstract： Ethanol method and microbiological method were used to extract flavonoids from purslane and Ginkgo biloba. DPPH radical scavenging effect of crude extraction was measured． The results showed that the rate of flavonids extracted from Ginkgo and purslane with ethanol method was 2．00％ and 4．37％. That from purslane and Ginkgo biloba with microbial method was 2．07％ and 4．84％． Scavenging of DPPH radicals of microbial extract at the same dilution factor was higher than that of ethanol extract， indicating that microbiologial method of extracting the flavonoids from plants had certain feasibility and superiority．
Key words： Portulaca oleracea L．；leaves of Ginkgo biloba L．；flavonoids； microorganism； DPPH
收稿日期：2014－09－29
基金项目：北京市教育委员会科技计划面上项目（KM201310011007）；质检公益性行业科研专项（20141009）
作者简介：王冬冬（1989－），女，河北邢台人，在读硕士研究生，研究方向为植物功效成分开发应用，（电话）13426015179（电子信箱）
jingyingwdd@sina．com；通信作者，王昌涛（1975－），男，教授，（电子信箱）wangct@th．btbu．edu．cn。
植物活性成分包括黄酮、多酚、生物碱、皂苷等，广泛存在于植物的叶、根、茎、果实中，是综合利用的植物资源。植物活性成分具有抗氧化、抗菌、预防或抑制肿瘤等生理功能。植物活性成分因其高的安全性，已渗入到食品、医药、化妆品等行业［1，2］。因此，利用各种提取技术从植物中提取具有高活性的成分已经成为目前的研究热点。传统的提取技术包括有机溶剂提取法、热水提取法、系统溶剂提取法等，但产品安全性低、耗时长、提取率低。安全性高、提取率高和环保的新型提取方法越来越受人们的关注。微生物法提取植物活性成分是利用微生物在生长过程中分泌的多种酶，从而对植物中的活性成分进行提取和修饰［3－7］。
本研究以2种提取黄酮较为普遍的马齿苋（Portulaca oleracea L．）和银杏（Ginkgo biloba L．）叶为对象，以乙醇提取和微生物提取作为对比，检测提取液中总黄酮的含量和提取液对DPPH自由基的清除作用，初步探究微生物法提取植物中黄酮的可行性与优越性。
1 材料与方法
1．1 材料与仪器
1．1．1 菌种 黄酒酵母，购自北京市食品酿造研究所。
1．1．2 供试材料 马齿苋、银杏叶，60 ℃烘干至恒重，粉碎过50目筛备用。
1．1．3 试剂 芦丁标准品（生化试剂，中国药品生物制品检定所）；DPPH（1，1－二苯基－2－三硝基苯肼）购自美国Sigma公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为市售国产分析纯。
1．1．4 仪器 高压灭菌锅（上海申安医疗机械厂）、全温度振荡培养箱（太仓华美生化仪器厂）、水浴恒温摇床（太仓华美生化仪器厂）、低速大容量台式离心机、紫外分光光度计UV－1240（日本岛津）等。
1．2 黄酮的提取
1．2．1 乙醇提取黄酮 分别称取5 g马齿苋和银杏叶粉末，按照1∶50料液比（g∶mL，下同）， 加入体积分数为60％的乙醇250 mL，于70 ℃水浴摇床中提取3 h，冷却后4 000 r/min离心10 min，取上清液待测［8－12］。
1．2．2 微生物法提取黄酮 分别称取5 g马齿苋粉和银杏叶粉，按照1∶50的料液比，加入去离子水250 mL，接入5％的黄酒酵母扩培菌液，于28 ℃、180 r/min的空气摇床中提取48 h，4 000 r/min离心10 min，取上清液待测。
1．3 黄酮含量的测定
1．3．1 标准曲线的绘制 准确配制1 mg/mL芦丁标准液，精确吸取0．2、0．3、0．4、0．5、0．6、0．7 mL芦丁标准液，补齐至1 mL，各加入0．3 mL 5％亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6 min，加入0．3 mL 10％硝酸铝溶液，摇匀，放置6 min，加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液，再加0．4 mL去离子水，摇匀，放置10 min，以空白试剂为对照，在510 nm下测吸光度。以芦丁浓度为横坐标（x），以吸光度（y）为纵坐标绘制标准曲线。
1．3．2 黄酮提取率的测定 准确吸取1 mL的提取液，各加入0．3 mL 5％亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6 min，加入0．3 mL 10％硝酸铝溶液，摇匀，放置6 min，加入4 mL 1mol/L NaOH溶液，再加0．4 mL去离子水，摇匀，放置10 min，以提取溶剂作为空白对照，在510 nm下测其吸光度，由标准曲线计算出提取液中黄酮的含量。
黄酮提取率＝提取液中黄酮含量×提取液总体积/原料质量×100％
1．4 粗提液对DPPH自由基的清除作用
将提取液用提取溶剂稀释梯度作为待测液，取等体积的待测液与2×10－4mol/L的DPPH溶液混匀为A1管；取等体积的无水乙醇与2×10－4 mol/L的DPPH溶液混匀为A2管；取等体积的无水乙醇与待测液混匀为A3管。反应30 min后，在517 nm下测A1、A2、A3管吸光度［13－15］。清除率计算公式为：
清除率＝［（A2＋A3）－A1］/A2×100％。
2 结果与分析
2．1 芦丁标准曲线
对芦丁标准液的浓度和吸光度进行线性回归处理，计算得回归方程：y＝1．098 9x＋0．006 6，R2＝0．999 5（图1）。
2．2 黄酮提取率
以体积分数为60％的乙醇溶液提取马齿苋黄酮和银杏叶黄酮，粗提液中黄酮的总质量分别为99．81 mg和218．38 mg，提取率分别为2．00％和4．37％，以黄酒酵母提取马齿苋黄酮和银杏叶黄酮，粗提液中黄酮的总质量分别为103．38 mg和241．98 mg，提取率分别为2．07％和4．84％（图2和图3），马齿苋和银杏叶的微生物提取黄酮的提取率在一定程度上均高于乙醇提取率。
2．3 粗提液对DPPH自由基的清除作用
马齿苋和银杏叶的乙醇提取液和微生物提取液对DPPH自由基的清除作用见图4和图5。从图4和图5中可以看出，相同的稀释倍数马齿苋和银杏叶的微生物提取液对DPPH自由基的清除率均高于乙醇提取液，即微生物提取液的抗氧化性高于乙醇提取液的抗氧化性。
3 小结与讨论
本研究采用乙醇提取和微生物提取的方式对马齿苋和银杏叶进行黄酮的提取，结果表明，微生物提取液中的黄酮含量高于乙醇的提取液，2种方法的提取液对DPPH自由基清除作用的测定结果表明，微生物提取液的清除作用要高于乙醇提取液，可初步表明微生物提取方式提取了更多的黄酮，提取液具有更高的抗氧化活性。微生物法不必使用有机试剂、温度适中、对环境无污染，更环保，更有效。对马齿苋和银杏叶这2种植物的初步分析结果可为其他植物进行微生物提取黄酮或者其他活性成分提供参考和借鉴。
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