刘友勋１，２，闫明阳１，赵春澎１，黄 娟１
（１．新乡医学院基础医学院，河南 新乡 ４５３００３；２．华中科技大学生命科学与技术学院，武汉 ４３００７４）
摘要：对漆斑菌（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｓｐ． ＩＭＥＲ１）菌株液体发酵产胆红素氧化酶的条件进行了优化。采用单因素试验筛选出最适碳源为葡萄糖，氮源为硝酸铵，ｐＨ为７，温度为２８ ℃和最有效促进产酶的金属离子为Ｃｕ２＋。在此基础上，利用Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ 设计对影响产酶因素的效应进行评价，筛选出具有显著影响的3个因素葡萄糖、ｐＨ和温度。用最陡爬坡路径逼近最大产酶区域后，利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化，得出ｐＨ、温度和葡萄糖分别为５．７、２８ ℃、８ ｇ／Ｌ时，优化后液体发酵液中胆红素氧化酶活力提高到０．６２７ Ｕ／ｍＬ，比未优化前的酶活力０．２１４ Ｕ／ｍＬ提高了近2倍，结果表明单因素与响应面结合法可优化菌株ＩＭＥＲ１液体发酵产胆红素氧化酶的条件。
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关键词 ：胆红素氧化酶；漆斑菌（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｓｐ． ＩＭＥＲ１）；Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计；响应面法
中图分类号：Ｑ５５６文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）05－1150-05
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.031
收稿日期：２０１４－０８－０８
基金项目：国家自然科学基金项目（Ｕ１３０４３０２）；河南省教育厅科学技术研究重点项目（１２Ｂ１８００３０）
作者简介：刘友勋（１９７６－），男，湖北鄂州人，副教授，博士，主要从事酶工程及生物转化研究，（电话）15225916528（电子信箱）ｌｉｕｙｏｕｘｕｎ＠１２６．ｃｏｍ；
通信作者，黄 娟，讲师，主要从事酶工程研究，（电子信箱）ｓａｂｒｉｎａ０４１０＠１２６．ｃｏｍ。
漆斑菌属（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）是一种无性型丝状真菌，属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目瘤座孢科（Ｔｕｂｅｒｃｕｌａｒｉａｃｅａｅ）。漆斑菌属是产胆红素氧化酶的主要真菌，工业上常用该属菌株生产胆红素氧化酶（Ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ｏｘｉｄａｓｅ， ＢＯＸ）［１］。胆红素氧化酶是一种含铜的多酚氧化酶， 能催化胆红素氧化， 氧气是其电子受体。反应过程为胆红素氧化酶催化胆红素生成胆绿素， 后者可进一步氧化最终生成无色化合物［２－４］。在临床检验中，常使用胆红素氧化酶来测定血液中胆红素的含量。相比较其他胆红素测定方法，酶学方法具有特异性、灵敏度高和操作简便等优点，适用于临床手工或自动化检测［５，６］。近年来，由于胆红素氧化酶的底物范围广和氧化能力强， 目前已被用于生物电池的制造、 污水处理等方面的研究［７－１１］。
响应面法是利用合理的试验设计并通过试验得到的一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。该方法在优化研究中应用频繁，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量、解决生产过程中实际问题的一种有效方法，已广泛地应用于农业、生物、食品、化学、制造等领域［１２］。为了提高漆斑菌产ＢＯＸ的能力，使其产酶量达到工业生产规模的需求，本试验对漆斑菌菌株Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｓｐ．ＩＭＥＲ１在液体培养体系中发酵产酶的影响因子进行了研究和优化。
１ 材料与方法
１．１ 材料与仪器
供试漆斑菌ＩＭＥＲ１，从武汉植物园土壤中分离得到；２，２－连氮－双（３－乙基苯并噻唑－６－磺酸铵）（ＡＢＴＳ）,美国ＳＩＧＭＡ公司；马铃薯液体培养基（ＰＤＢ）：２０％马铃薯（削片煮水）＋２％葡萄糖。
紫外可见分光光度仪（ＵＮＩＣＯ－ＵＶ－２０００型），上海尤尼柯仪器有限公司；台式高速冷冻离心机（ＴＧＬ－１６／ＴＧＬ１６型），湖南湘仪集团；全温气浴振荡摇床（ＺＤ－８８型），金坛市成辉仪器厂。
１．２ 方法
１．２．１ 液体培养 IＭＥＲ１菌株斜面培养于ＰＤＡ培养基中，２６～２７ ℃静置，通常５～７ ｄ可产生大量的分生孢子，用适量的蒸馏水将试管中的孢子冲洗出来，通过显微计数，将孢子数量调整到１×１０８ 个／ｍＬ，使用前将孢子悬浮液摇匀。用移液枪吸取不同量孢子液注射入灭菌后的培养基中。将接种的培养基放在摇床中，１５０ ｒ／ｍｉｎ下振荡培养，根据需要调整培养液的起始ｐＨ和培养温度。菌株ＩＭＥＲ１在液体基质中培养一段时间后， 将菌丝过滤即得到粗酶液。
１．２．２ 酶活测定 酶活测定采用ＡＢＴＳ法，教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献［１３］。在３ ｍＬ反应体系中，含有２．７ ｍＬ ｐＨ ４．５的０．２ ｍｏｌ／Ｌ乙酸－乙酸钠缓冲液、０．１ ｍＬ酶液、０．２ ｍＬ １ ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＢＴＳ，按次序混合并摇匀，３０ ｓ后开始记录Ａ４２０ ｎｍ，每隔１５ ｓ记录一个Ａ４２０ ｎｍ值。一个酶活力单位（Ｕ）：在上述条件下，每分钟催化１ μｍｏｌ ＡＢＴＳ氧化所需的酶量。
１．2.３ 单因素试验 筛选漆斑菌ＩＭＥＲ１培养的最适碳源、氮源、ｐＨ、温度和金属离子。①碳源。采用不同碳源木糖、甘露糖、蔗糖、葡萄糖、微晶纤维素添加到培养基中，测定菌株ＩＭＥＲ１产ＢＯＸ的相对酶活；②氮源。采用有机氮源（蛋白胨、尿素、酵母浸膏）和无机氮源（硝酸铵、硫酸铵）添加到培养基中，测定菌株ＩＭＥＲ１产ＢＯＸ的相对酶活；③ｐＨ。调节培养基使其处于不同的ｐＨ（４、５、６、７、８、９、１０、１１），测定菌株ＩＭＥＲ１产ＢＯＸ的相对酶活；④温度。在不同的温度下培养（２２、２８、３２、３７ ℃）， 测定菌株ＩＭＥＲ１产ＢＯＸ的相对酶活；⑤金属离子。在培养基中添加不同金属离子（Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍg２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、 Ｆｅ３＋、 Ｃｏ２＋）， 测定菌株ＩＭＥＲ１产ＢＯＸ的相对酶活。
１．3 响应面设计和统计分析
采用
软件中的试验设计程序进行响应面分析，并利用该软件进行方差分析。
２ 结果与分析
２．１ 单因素试验结果
２．１．１ 不同碳源和氮源的影响 如图１所示，在对照培养基中，菌株ＩＭＥＲ１生长良好，但产酶量不大；在加入蔗糖和葡萄糖的培养基中，ＢＯＸ产量是对照的２．５倍；在加入微晶纤维素的培养基中，菌株ＩＭＥＲ１生长慢，但ＢＯＸ产量是对照的２倍左右；在加入木糖和甘露糖的培养基中，菌株ＩＭＥＲ１生长速度一般，ＢＯＸ产量比较低。结果表明，在对照培养基中，由于缺乏速效碳源，从而影响了ＢＯＸ的产量；葡萄糖作为速效碳源可明显提高ＢＯＸ产量，蔗糖也有类似的效果，可能是因为蔗糖水解后也可产生葡萄糖；而木糖和甘露糖对菌株生长和ＢＯＸ的分泌具有一定的抑制作用；微晶纤维素虽然不能促进菌株ＩＭＥＲ１的生长，但可以促进其产酶。
如图２所示，和对照相比，在不同氮源中硝酸铵对菌株ＩＭＥＲ１产ＢＯＸ酶有明显的促进作用，而尿素对产酶有抑制作用。有机氮源（蛋白胨、尿素、酵母浸膏）和无机氮源（硝酸铵、硫酸铵）相比，无机氮源作为一种速效氮源对产酶的影响较大。
２．１．２ 不同ｐＨ的影响 如图３所示，培养基ｐＨ 为７是该菌产酶的最适ｐＨ，在中性偏碱性的环境（ｐＨ ７～9）中，ＢＯＸ产量要比在酸性环境高，且在ｐＨ ４、５时菌株IMER1生长较差，而在碱性环境下，生长较好。表明菌株ＩＭＥＲ１作为一种耐碱性真菌，在中性偏碱性的ｐＨ范围内能较好地分泌ＢＯＸ。
２．１．３ 不同温度的影响 如图４所示，２８ ℃时菌株ＩＭＥＲ１的生长速度快，ＢＯＸ产量最大，而在较低温度２２ ℃时，该菌株生长较慢，酶产量也较低；在３７ ℃时，菌株ＩＭＥＲ１的孢子未能萌发，所以在其发酵液中未测到ＢＯＸ酶活。结果表明，最适的产酶温度为２８ ℃，高温会抑制孢子的萌发。
２．１．４ 不同金属离子的影响 如图５所示，Ｆｅ３＋和Ｍｎ２＋对菌株ＩＭＥＲ１产ＢＯＸ有一定的抑制作用，Ｋ＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋对产酶的影响较小，Ｎａ＋、Ｃｏ２＋离子对产ＢＯＸ有一定的促进作用，而Ｃｕ２＋对其产酶的促进作用最强。
２．２ 响应面法优化液体培养体系产酶条件
２．２．１ 主效因素的确定 Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ （ＰＢ）法是一种近饱和的２水平试验设计方法，它基于非完全平衡块原理，能用最少的试验次数估计出因素的主效应，从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素供进一步研究。根据上述单因素试验结果，影响菌株ＩＭＥＲ１液体发酵产酶的可能因素包括温度、ｐＨ、氮源、碳源（葡萄糖，Ｇｌｕ）、铜离子等。选用Ｎ＝８的Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计，并设３个空白作为误差分析项，结果见表１，各因素所代表的参数及因素效应评价见表２。由表２可知，对菌株ＩＭＥＲ１液体发酵产酶有显著影响的因素有碳源、ｐＨ和温度。温度对产酶呈正效应，碳源和ｐＨ则呈较大的负效应。要提高产酶量，应适当提高温度，降低葡萄糖的浓度。
２．２．２ 最陡爬坡试验确定响应面试验因素水平的中心点 根据Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ法筛选出的显著因素效应大小设定它们的步长，进行最陡爬坡试验设计，寻找最大产酶区。根据Ｇｌｕ、ｐＨ和温度３个因素效应大小的比例设定它们的变化方向及步长，最陡爬坡试验设计及试验测得结果如表３所示，最大产酶区在第３次试验附近，故以试验３的条件为响应面试验因素水平的中心点。根据Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ试验和最陡爬坡试验确定的试验因素与水平详见表４。
２．２．３ 响应面设计确定显著因素的最优水平 利用最大产酶区对应的条件进行响应面中心组合试验设计，以试验结果拟合建立描述响应量（BOX酶活）与自变量（影响产酶的显著因素）关系的多项式回归模型，运用ＳＡＳ软件对试验数据进行回归拟合，并对拟合方程作显著性检验及方差分析。三因素五水平的响应面中心组合试验设计及试验测得的酶活力结果见表５。
１）回归模型的建立及置信度分析。以ＢＯＸ酶活为响应值，根据表５的试验结果，用ＳＡＳ统计分析软件进行多元回归分析，所得的主要分析结果见表６、表７。从方差分析中可以看出，各试验因素响应值的影响不是简单的线性关系。根据试验因素对响应值的影响，拟合得到多项式回归模型为：Ｙ１＝０．６４２ ９６３＋０．０１４ ７２２×ｐＨ＋０．００４ ４４×Ｇｌｕ－０．１５３ ０５６×Ｔ－０．０９９ ５３７×ｐＨ×ｐＨ＋０．０５８ ８８９×ｐＨ×Ｇｌｕ－０．００５×ｐＨ×Ｔ－０．０６７ ８７×Ｇｌｕ×Ｇｌｕ＋０．０９８ ８８９×Ｇｌｕ×Ｔ－０．０７６ ２０４×Ｔ×Ｔ。
从表６中可以看出，用上述回归方程描述各因素与响应值之间的关系时，其因变量和自变量之间的线性关系是显著的，决定系数为９８．７１％，说明回归方程的拟合程度很好。
２）显著因素水平的优化和验证。运用ＳＡＳ软件对回归模型进行规范性分析，寻求最大酶活量的稳定点及对应的因素水平，结合图６的回归方程的三维响应面图和等高线图可知，回归模型存在稳定点，对应的ｐＨ、Ｔ、Ｇｌｕ实际取值分别为５．７、２８ ℃、８ ｇ／Ｌ，ＢＯＸ酶活的最大估计值为０．６４３ Ｕ／ｍＬ。在以上优化条件下进行验证试验，共进行３次１００ ｍＬ的摇瓶试验，ＢＯＸ酶活分别为０．５８２、０．６３９、０．６６２ Ｕ／ｍＬ，平均值为０．６２７ Ｕ／ｍＬ。证明预测值０．６４３ Ｕ／ｍＬ与试验平均值０．６２７ Ｕ／ｍＬ非常接近，同时比没有优化前的酶活力０．２１４ Ｕ／ｍＬ提高了近2倍。
３ 小结
漆斑菌属是产ＢＯＸ的主要真菌，有关其产酶条件的优化报道不多。多数微生物产酶条件优化采用单因素试验、正交试验及响应面试验分析，这些方法存在一定的缺陷［１４］。本试验通过整合单因素试验和Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计，结合最陡爬坡路径试验和响应面中心组合设计，对菌株Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｓｐ．ＩＭＥＲ１在液体培养体系中高效产胆红素氧化酶条件进行了优化，获得了比较理想的结果。菌株ＩＭＥＲ１以ＰＤＢ培养基为基础，在外加碳源和氮源中，葡萄糖、蔗糖和硝酸铵能提高ＢＯＸ产量；在中性偏碱性的ｐＨ 7～9范围内，ＢＯＸ产量要比在酸性条件下高，其最适产酶ｐＨ为７；最适产酶温度为２８ ℃；在培养基中加入Ｃｕ２＋对产ＢＯＸ有明显的促进作用。运用响应面法优化液体体系产ＢＯＸ酶的条件，结果表明，在ｐＨ、温度、Ｃｕ２＋、碳源和氮源等影响因素中，ｐＨ、温度和碳源属于主效因子。当ｐＨ、温度和葡萄糖分别为５．７、２８ ℃、８ ｇ／Ｌ时，酶活力可达到最大优化值，比没有优化前的酶活力量提高近2倍。
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（责任编辑 赵 娟）