王书珍，金卫斌，项俊，郑永良，方元平，干建平，程华，杜航
（经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室／黄冈师范学院生命科学学院，湖北黄冈 ４３８０００）
摘要：利用ＦＩＡＳＣＯ方法（Ｆａｓｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＡＦＬＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＣＯｎｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｐｅａｔｓ）构建杜鹃（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｉｍｓｉｉ Ｐｌａｎｃｈ.）的（ＡＧ）ｎ微卫星富集文库。通过菌液ＰＣＲ检测，从（ＡＧ）ｎ微卫星富集文库的３５６个阳性菌落中筛选了２３３个进行测序分析。结果表明，２０２个序列富含ＳＳＲ位点，阳性比率达８６．７％。去除杂峰、叠峰、信号弱的序列，最终筛选３９个供后续引物开发使用，其中完美型ＳＳＲ有２２个，不完美型５个，混合型１２个。磁珠富集法构建杜鹃基因组微卫星文库是一条高效可行的途径，为微卫星位点的分离、杜鹃种群遗传多样性和遗传结构的研究奠定了基础。
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关键词 ：杜鹃（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｉｍｓｉｉ Ｐｌａｎｃｈ．）；微卫星；探针；富集文库
中图分类号：Ｓ６８５．２１；Ｑ３４３．１文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）03－0６２７-0４
杜鹃花（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｐｐ．）泛指杜鹃花科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）杜鹃花属（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏn）植物，具有极高的观赏价值，并被誉为“花中西施”和“木本花卉之王”［１，２］。杜鹃花在亚洲、欧洲、北美洲等地广泛分布，并且因气候条件不同而垂直分布明显，从而形成了常绿大乔木、常绿小乔木、常绿灌木、落叶灌木等不同形态特征的地理居群［３］。杜鹃花兼有美学观赏、生态保护、药用治疗、科学研究等价值［１］。杜鹃花属近１ ０００种，中国有５７１种，其中特有种多达４００多个［４］。在中国，云南、西藏、四川三省（自治区）交汇处的横断山脉是世界杜鹃花的发源地和分布中心［５］。近几年来，在气候变化与人类活动日渐加剧的大背景下，杜鹃花的种质资源也受到不同程度的影响，甚至出现退化现象。因此，亟须对现有的杜鹃花资源进行科学的评价，并制定切实可行的遗传保护策略。
微卫星（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ），又称简单重复序列（Ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ，ＳＳＲ），是以１～６ ｂｐ核苷酸为重复单位且均匀分布于生物基因组中的串联重复序列。微卫星标记因其分布广泛、多态性强、信息含量丰富、遗传稳定性好、共显性遗传等特点，而被广泛应用于作物的遗传结构分析、遗传育种、图谱构建、基因定位、亲缘关系分析及种质资源鉴定等研究中［６－９］。Ｎａｉｔｏ等［１０］率先从Ｒ． ｍｅｔｔｅｒｎｉｃｈｉｉ基因组内开发了ＳＳＲ分子标记。Ｔａｎ等［１１］从 Ｒ． ｓｉｍｓｉｉ 基因组内开发了８个ＳＳＲ标记。Ｗａｎｇ等［１２］从Ｒ． ｄｅｃｏｒｕｍ基因组内开发了２４个微卫星标记。Ｗａｎｇ 等［１３］从 Ｒ． ｄｅｌａｖａｙｉ 和 Ｒ． ｄｅｃｏｒｕｍ基因组内开发了３８对ＳＳＲ引物，其中９对可以跨物种扩增。Delmas等［14］Ｃｈａｒｒｉｅｒ等［１５］用４５４ 焦磷酸测序技术从Ｒ． ｆｅｒｒｕｇｉｎｅｕｍ基因组内开发了１８个微卫星标记。
现有的ＳＳＲ标记难以满足对杜鹃花种群的遗传变异特征、基因流、种群进化历史、遗传图谱构建等研究中对微卫星标记数量的需求。因此，本研究以（ＡＧ）ｎ为探针构建杜鹃花特有种杜鹃（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｉｍｓｉｉ Ｐｌａｎｃｈ．）的基因组微卫星富集文库，旨在为杜鹃花群体遗传学分析、遗传图谱构建、花期性状基因的关联分析、ＱＴＬ定位等研究提供高效的ＳＳＲ标记。
１材料与方法
１．１材料
１．１．１材料来源杜鹃样品取自湖北省麻城市龟峰山山顶“杜鹃花王”的幼嫩叶片。样品采集后置于自封袋内，并放入冰盒中，带回实验室置－８０ °Ｃ冰箱备用。
１．１．２试剂ＤＮＡ限制性内切酶ＭｓｅＩ、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶购自ＮＥＢ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、ｄＮＴＰｓ均购天根生物公司。链霉亲和素磁珠Ｍ－２８０试剂盒（Ｄｙｎａｌｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，１１２－０５Ｄ）、磁珠收集器（Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ，１２３－２０Ｄ）购于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ。克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ购于ＴａＫａＲａ，转化用的大肠杆菌ＴＯＰ１０感受态细胞由经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室保存。ＡＦＬＰ接头序列Ｏｌｉｇｏ－ＭｓｅＩ－Ａ（５′－ＴＡＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴ－３′）和Ｏｌｉｇｏ－ＭｓｅＩ－Ｂ（５′－ＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧ－３′）由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。生物素标记的（ＡＧ）ｎ探针由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ生物公司合成： ５′－Ｂｉｏｔｉｎ－（ＡＧ）１３。ＭｓｅＩ－Ｎ混合组由上海生工生物工程技术服务有限公司合成：５′－ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＮ－３′，Ｎ＝Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｃ。Ｍ１３通用引物由南京金斯瑞生物公司合成。
１．２ 方法
１．２．１基因组ＤＮＡ 提取ＤＮＡ提取方法参照改良的ＣＴＡＢ提取法［１６］，并略作修改。提取的“杜鹃花王”基因组ＤＮＡ经０．８％琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计检测后，记录原始结果，并将基因组ＤＮＡ稀释至终浓度为１００ ｎｇ／μＬ，－２０ ℃保存备用。
１．２．２微卫星富集文库的构建参照ＦＩＡＳＣＯ（Ｆａｓｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＡＦＬＰ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＣOｎｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｐｅａｔｓ）方法构建微卫星富集文库［１７］。利用ＭｓｅＩ 限制性内切酶对１ μｇ的基因组ＤＮＡ进行酶切，酶切成功的标准是出现１００～１ ０００ ｂｐ的弥散带谱；将酶切后的基因组 ＤＮＡ 片段回收并加 Ｍｓｅ Ｉ接头（Ｏｌｉｇｏ－ＭｓｅＩ Ａ 和Ｏｌｉｇｏ－ＭｓｅＩ Ｂ）；利用Ｍｓｅ Ｉ－Ｎ引物对连接片段进行预扩增（１２／１４／１６／１８／２０个循环），筛选扩增产物刚刚能在琼脂糖凝胶上呈现的扩增产物（１００~１ ０００ ｂｐ）；将预扩增产物先后与Ｂｉｏｔｉｎ－（ＡＧ）１３ 探针和链霉亲和素包被的磁珠进行杂交，经过系列非严格洗脱和严格洗脱后回收目的ＤＮＡ片段；对回收的ＤＮＡ片段进行３０个循环的ＰＣＲ扩增，回收２００～８００ ｂｐ的片段，与ｐＭＤ１８－Ｔ载体进行ＴＡ克隆并转化到大肠杆菌ＴＯＰ１０感受态细胞内，涂布在含有氨苄霉素的培养基上。
１．２．３阳性克隆的测序及分析经氨苄抗性筛选和ＩＰＴＧ诱导后，挑取白色克隆。以Ｍ１３通用引物进行菌液ＰＣＲ检测，扩增产物在１％的琼脂糖凝胶上电泳分析，挑取扩增片段大于５００ ｂｐ的克隆交由南京金斯瑞生物科技有限公司测序。以Ｍ１３通用引物进行双向测序，序列比对拼接后用在线软件ＶｅｃＳｃｒｅｅｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＶｅｃＳｃｒｅｅｎ／）去除载体序列和ＭｓｅＩ接头序列。利用软件ＴＲＦ（Ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ ｆｉｎｄｅｒ，ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２．１）［１７］查找序列的微卫星位点。按照Ｗｅｂｅｒ［１８］的微卫星分类标准对杜鹃花基因组ＳＳＲ位点进行分类。
２结果与分析
２．１提取的杜鹃基因组ＤＮＡ
提取的“杜鹃花王”基因组ＤＮＡ在０．８％的琼脂糖凝胶上呈现比较完整的ＤＮＡ条带，条带大于２０ ｋｂ，并且无明显的ＤＮＡ降解现象（图１）。利用紫外分光光度计对提取的“杜鹃花王”基因组ＤＮＡ进行检测，发现改良的ＣＴＡＢ法所提取的杜鹃花基因组ＤＮＡ浓度和纯度均比较好，ＯＤ２６０ ｎｍ／ＯＤ２８０ ｎｍ＝１．７４６ ３，ＤＮＡ的浓度为３．７６ μｇ／μＬ。因此，提取的ＤＮＡ适合后续杜鹃花微卫星富集文库的构建。
２．２微卫星富集文库的构建以及鉴定
对１ μｇ“杜鹃花王”基因组ＤＮＡ的酶切结果见图２，与未处理的对照样品相比，经ＭｓｅＩ限制性内切酶酶切的ＤＮＡ呈弥散带型，并且大小分布在１００～１ ０００ ｂｐ之间，符合微卫星富集文库构建的要求。将回收后的酶切片段与ＭｓｅＩ接头相连，并对连接产物进行预扩增。根据文献资料，设置不同的循环进行扩增。对比发现，１６个循环的扩增产物在琼脂糖凝胶上刚刚能够呈现，小于１４个循环的扩增产物太少而不适合下游的磁珠富集，而多于１８个循环的扩增产物过多，会导致下游阳性克隆子重复出现，因此选择１６个循环的扩增产物与Ｂｉｏｔｉｎ－（ＡＧ）１３探针进行杂交。经多次杂片段的洗脱后，采用９５ ℃预热的ＴＥ溶液洗脱与探针杂交的目的片段，扩增３０个循环，并进行ＴＡ克隆转化到大肠杆菌ＴＯＰ１０细胞内构建微卫星富集文库。经氨苄抗性筛选和ＩＰＴＧ诱导后，从平板上挑取了３５６个克隆子。经菌液ＰＣＲ检测，挑取２３３个克隆片段大于５００ ｂｐ的克隆交由测序公司测序（图３）。
２．３测序分析
对上述测序的克隆，舍弃杂峰、信号弱的序列，最终得到（ＡＧ）ｎ微卫星富集文库的２０２条序列片段，部分测序结果见图４。在富含微卫星位点的２０２条序列内，有２６个序列在微卫星位点的下游出现了叠峰；还有３１个序列在微卫星位点的上游侧翼序列过短，不适合后续的ＳＳＲ引物设计；６个克隆与其他序列有重复。因此，最后挑选了１３９个序列供后续研究。
利用在线ＴＲＦ软件对１３９条微卫星序列片段进行分析，（ＡＧ）ｎ文库内序列的主要重复类型为（ＡＧ）ｎ、（ＧＡ）ｎ、（ＣＴ）ｎ、（ＴＣ）ｎ，以及由这些微卫星重复单元组成的复合型微卫星。在所检测的微卫星位点内，重复次数最少为８次，最多可达３６次，主要重复次数分布在２２～３１之间。不完美型的微卫星位点，重复序列之间插入的碱基数为３～７个，以胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸碱基居多。复合型微卫星内既有（ＴＣ）ｎ与（ＴＡ）ｎ双碱基重复的混合类型，也有（ＧＡ）ｎ与（ＡＴ）ｎ混合的类型，更有Ｃｎ和（ＣＴ）ｎ类型的重复组合。
利用Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０软件对重复次数大于１２的序列进行分析，有３９个序列能够设计出得分大于８５分的ＳＳＲ引物，可用于ＳＳＲ引物开发的序列。这３９个序列内部的微卫星类型、５′核心序列、３′端侧翼序列如表１所示。依据Ｗｅｂｅｒ［１９］提出的标准为序列进行分类，发现杜鹃的微卫星富集文库内以完美型微卫星类型居多：完美型ＳＳＲ有２２个，占５６．４１％；不完美型５个，占１２．８２％；混合型ＳＳＲ有１２个，占３０．７７％。
３小结与讨论
在湖北麻城的龟峰山风景区内，有着连片面积达6 000多公顷的杜鹃花灌木丛，建群种主要是杜鹃。该杜鹃群落的平均树龄在１００～３００年之间，而被誉为“杜鹃花王”的树龄大于５００年，是世界上迄今为止发现的面积最大、品种最纯、分布最集中的野生古杜鹃群落。龟峰山风景区的杜鹃特有种和变种不仅为湖北省生态旅游业的发展奠定了基础，也为杜鹃的遗传育种提供了优良的材料［６］。因此，亟须对麻城杜鹃种质资源进行研究，而ＳＳＲ标记的开发是首要任务，微卫星富集文库的构建则是从基因组信息未知的物种内开发ＳＳＲ标记的前提。
微卫星标记可以通过基因组分离、数据库挖掘、近缘物种转移等途径获得。微卫星标记的开发是一件繁琐且耗时的工作，传统的微卫星分离方法效率低且耗时，阳性率多为０．０４％～１２％［２０］。本研究通过对基因组ＤＮＡ的ＭｓｅＩ酶切、特定接头的连接、ＭｓｅＩ－Ｎ简并引物的ＰＣＲ预扩增、生物素探针杂交、磁珠富集、多次洗脱、回收目的片段等途径构建了杜鹃花（ＡＧ）ｎ微卫星富集文库，阳性克隆比率高达８６．７％。
在构建（ＡＧ）ｎ文库的同时，也同时利用生物素标记的（ＡＴ）１３、（ＧＣＣ）９、（ＣＴＡＴ）６探针构建富集文库，但最终只从筛选平板上各挑取了１５、９、７个克隆，测序分析均为阴性，可能的原因是杜鹃花基因组内（ＡＴ）ｎ、（ＧＣＣ）ｎ、（ＣＴＡＴ）ｎ类型的微卫星位点比较少见。在（ＡＧ）ｎ文库的构建过程中，选择的是（ＡＧ）１３探针，主要是因为探针中碱基的增加会直接影响杂交退火温度和杂交的效率，而碱基过少则影响阳性克隆率。
采用菌液ＰＣＲ技术对克隆子进一步筛选，扩增片段长度大于５００ ｂｐ的克隆才会进行下一步的测序分析。Ｍ１３通用引物所扩增的片段包括载体序列和外源插入序列，因此如果片段过短，即便是含有微卫星位点，其两侧也没有足够的侧翼序列供ＳＳＲ引物的开发，因此选择片段长度大于５００ ｂｐ的克隆。据以往在莲、苦瓜、慈姑等物种内的研究经验，重复次数大于１２的二碱基微卫星位点在群体内的多态性比较丰富［１７］。因此，结合Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０软件的分析结果，最终筛选３９个序列以供后期杜鹃花基因组ＳＳＲ引物的设计。
综上所述，ＦＩＡＳＣＯ富集法能够有效地从杜鹃基因组ＤＮＡ内分离到微卫星座位，在所测序的２３３个克隆内，２０２个序列富含ＳＳＲ位点，阳性比率高达８６．７％，便于后续的引物设计与开发，同时为麻城龟峰山杜鹃种质资源现状的遗传评估、遗传结构分析、遗传图谱构建、目标性状关联分析、ＱＴＬ定位、种群进化潜力和进化路线的研究奠定了基础。
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