李铁军，丁邦琴，蔡 凤，陈玉霜
（南通职业大学化学与生物工程学院，江苏 南通 ２２６００７）
摘要：以枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＬＤＢ１为试验材料，研究其固体、液体培养条件下的抑菌谱情况，明确该菌株对植物病原真菌［水稻纹枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｌｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、苹果轮纹病菌（Ｐｈｙｓａｌｏｓｐｏｒａ ｐｉｒｉｃｏｌａ）、腐霉病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、油菜菌核病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、小麦全蚀病菌（Ｇａｅｔａｎａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、棉花枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ ． ｓｐ． Ｖａｓｉｎｆｅｃｔｕｍ）、小麦根腐病菌（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｏｒｏｋｉａｎｕｍ），番茄灰霉病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ Ｐｅｒｓ）］的抑制效果。结果表明，两种培养条件下对供试的８种植物病原真菌均有较好的抑制效果；除水稻纹枯病菌和苹果轮纹病菌外，液体培养对其他５种病原菌的抑制作用优于固体培养，比较分析显示两种培养方式处理差异显著。
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关键词 ：生防菌；枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＬＤＢ１；植物病原真菌；抑制作用
中图分类号：Ｓ４７６．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０２－０３４１－０５
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０２．０２１
化学杀菌剂暴露出的诸多难以克服的缺点使新型生防菌剂的研发成为农业有害生物防治热门。拮抗细菌在植物病害防治中起到了非常重要的作用，无论是在自然发生的生物拮抗现象还是在生物防治中，细菌的生防效果都非常明显［１］。在众多的生防细菌中，枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ sｕｂｔｉｌｉｓ）凭借其易培养、环境适应能力强、对人畜无毒等优点而为人青睐［２，３］。枯草芽孢杆菌用于防治的植物病害主要包括蔬菜病害［４］、作物病害［５］、林木果树病害［６］，在用于植物病害的生物防治方面的研究和开发应用取得令人瞩目的成就，美国已有４株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局（ＥＰＡ）商品化或有限商品化生产应用许可［７］；中国已开发出一批生防效果优良的枯草芽孢杆菌菌株［８］，如Ｂ９１６、Ｂ９０８、Ｂ３、Ｂ９０３、ＢＬ０３、ＸＭｌ６等。现有商品化的枯草芽孢杆菌制剂由于使用的枯草芽孢杆菌菌株不尽相同，防治对象也各不相同。本研究以枯草芽孢杆菌菌株ＬＤＢ１为试验材料，进行固体、液体培养条件下的抑菌谱比较，以明确该菌株对不同类型植物病原真菌的抑制效果，从而为生防菌菌株ＬＤＢ１制剂的研发、生产、田间应用提供理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 供试菌株 生防菌菌株ＬＤＢ１，由南通职业大学化学与生物工程学院实验室分离筛选得到，水稻纹枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｌｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、苹果轮纹病菌（Ｐｈｙｓａｌｏｓｐｏｒａ ｐｉｒｉｃｏｌａ）、腐霉病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、油菜菌核病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、小麦全蚀病菌（Ｇａｅｔａｎａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、棉花枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． Ｖａｓｉｎｆｅｃｔｕｍ）、小麦根腐病菌（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｏｒｏｋｉａｎｕｍ）、番茄灰霉病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ Ｐｅｒｓ）由南通职业大学化学与生物工程学院实验室提供。
１．１．２ 培养基 ＹＰＧＡ培养基（固体）：胰蛋白胨５ ｇ，酵母膏５ ｇ，葡萄糖２０ ｇ，琼脂１５ ｇ，蒸馏水１ ０００ ｍＬ。用于生防菌菌株ＬＤＢ１的活化及固体培养。
ＹＰＧＡ培养基（液体）：胰蛋白胨５ ｇ，酵母膏５ ｇ，葡萄糖２０ ｇ，蒸馏水１ ０００ ｍＬ。用于生防菌菌株ＬＤＢ１的液体发酵培养。
ＰＤＡ培养基：马铃薯２００ ｇ、 琼脂１５ ｇ、蔗糖２０ ｇ、蒸馏水１ ０００ ｍＬ。用于植物病原真菌的活化及培养。
１．１．３ 仪器和设备 分析天平，电磁炉，高压灭菌锅，超净工作台，恒温培养箱，恒温培养摇床，接种环（勾）、尺子、照相机、微波炉、报纸、纱布、铁架台、导管、试管、镊子、玻璃器皿等。
１．２ 方法
１．２．１ 菌种活化 细菌活化：在超净工作台中，用接种环在斜面上挑一环生防菌菌株ＬＤＢ１ 到新的ＹＰＧＡ固体斜面培养基上，“Ｚ”字形划线接种，在恒温培养箱中２６ ℃培养２ ｄ。
真菌活化：第一次活化。在超净工作台上，用接种针在斜面上挑一块真菌菌种接种到ＰＤＡ培养基的斜面上，在恒温培养箱中２６ ℃培养５～７ ｄ。第二次活化。在超净工作台上，用接种针在第一次活化培养的ＰＤＡ培养基斜面上挑一块真菌菌丝接种到ＰＤＡ平板中央。接种后，将培养皿放入２６ ℃的培养箱中培养至能打出满足试验所需的菌饼。
１．２．２ 生防菌菌株ＬＤＢ１固体培养下的抑菌谱测定 将ＰＤＡ培养基熔化后倒入培养皿冷凝后，采用平板对峙法［９］，在平板中央接种直径为５ ｍｍ的病原菌菌饼，在菌饼周围四角用接种环将活化的菌株ＬＤＢ１涂成５ ｍｍ直径的圆形，设置３个重复，对照组只接真菌菌饼不涂细菌。２６ ℃恒温培养至对照长满平板，用十字交叉法测量各培养皿中病原真菌的菌落直径［１０］，计算抑制率。抑制率＝（对照菌落直径－处理菌落直径）／对照菌落直径×１００％。
１．２．３ 生防菌菌株ＬＤＢ１发酵液的制备 采用摇瓶发酵培养法［１１］。在超净工作台中，用接种环取一环细菌接种到装有５０ ｍＬ ＹＰＧＡ培养基（液体）的２５０ ｍＬ三角锥形瓶中，摇床转速１３０ ｒ／ｍｉｎ，２６ ℃振荡培养４８ ｈ。
１．２．４ 生防菌菌株ＬＤＢ１液体培养下的抑菌谱测定 将ＰＤＡ培养基熔化后倒入培养皿冷凝，采用滤纸片法，在平板中央接种直径为５ ｍｍ的病原菌菌饼，在菌饼周围四角用无菌镊子放置直径为５ ｍｍ的灭菌滤纸片，用滴管在每个滤纸片上滴加等量菌株ＬＤＢ１的发酵液，设置３个重复，对照组只接真菌菌饼不加发酵液。２６ ℃恒温培养至对照菌落长满平板。用十字交叉法测量各培养皿中病原真菌的菌落直径，计算抑制率。
２ 结果与分析
２．１ 生防菌菌株ＬＤＢ１固体培养对病原真菌的抑菌谱
生防菌菌株ＬＤＢ１固体培养对病原真菌的抑制作用测定结果（表１、图１、图２）表明，生防菌菌株ＬＤＢ１固体培养对供试病原真菌皆具有不同程度的抑制作用，对水稻纹枯病菌、苹果轮纹病菌、小麦全蚀病菌、小麦根腐病菌、腐霉病菌、油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌、番茄灰霉病菌的抑制率分别为２９．４％、３４．１％、２４．７％、１８．８％、１１．８％、２５．６％、３３．３％、２４．２％。其中对苹果轮纹病菌和棉花枯萎病菌的抑制作用较强，对腐霉病菌的抑制作用较弱。
通过ＳＰＳＳ １８．０统计软件邓肯氏多重比较，在０．０５水平，生防菌菌株ＬＤＢ１对棉花枯萎病菌和苹果轮纹病菌的抑制作用差异不显著，但是对这２种病菌的抑制作用与其他６种病菌相比差异显著，说明固体培养条件下菌株ＬＤＢ１对棉花枯萎病菌和苹果轮纹病菌的抑制作用较强。
２．２ 生防菌菌株ＬＤＢ１液体培养对８种病原真菌的抑菌谱
生防菌菌株ＬＤＢ１液体培养对病原真菌的抑制作用测定结果（表１、图３、图４）表明，生防菌菌株ＬＤＢ１液体培养对供试病原真菌也有不同程度的抑制作用，其对水稻纹枯病菌、苹果轮纹病菌、小麦全蚀病菌、腐霉病菌、小麦根腐病菌、油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌、番茄灰霉病菌的抑制率分别为２７．１％、２８．２％、２５．９％、２４．６％、２７．１％、２６．７％、３４．２％、２７．８％。其中对棉花枯萎病菌的抑制作用最强，对腐霉病菌的抑制作用比较弱。
进行比较分析表明，在０．０５水平，生防菌菌株ＬＤＢ１对棉花枯萎病菌的抑制作用与对其他７种病菌的抑制作用相比差异显著，但是对水稻纹枯病菌、苹果轮纹病菌、小麦全蚀病菌、腐霉病菌、小麦根腐病菌、油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌这７种病菌的抑制作用差异不显著，可见液体培养条件下该菌对棉花枯萎病菌的抑制作用较强。
２．３ 不同处理生防菌菌株ＬＤＢ１抑菌谱比较
除水稻纹枯病菌和苹果轮纹病菌外，生防菌菌株ＬＤＢ１液体培养对其他５种病原菌的抑制作用比其固体培养强，且经过比较分析表明，在０．０５的水平上，２种处理方式差异显著。可见，生防菌菌株ＬＤＢ１对供试的８种病原真菌抑制效果虽然各不相同，但均表现了较好的抑制效果，具有广谱抗真菌作用。
３ 小结与讨论
枯草芽孢杆菌是具有较高生物应用价值潜力的菌种之一，国内外对于芽孢杆菌应用方面的研究日益增多，枯草芽孢杆菌作为一种生防细菌越来越引起人们的关注［１２］。本研究选用的生防菌菌株ＬＤＢ１在实验室条件下对多种植物病原真菌表现了良好的抑制作用，是一种广谱拮抗菌。在接种量以及培养条件相同的情况下，该菌株对不同病原真菌的抑制作用不同，原因可能与真菌的生长速度有关。本研究观察发现，番茄灰霉病菌在２６ ℃恒温培养条件下接种５ ｍｍ直径的菌饼生长速度很慢，还未开始生长前，接种的生防菌菌株ＬＤＢ１就几乎长满平板，因此先接种真菌培养４８ ｈ后再接种细菌。另外，该生防菌对不同病原真菌的抑制作用不同，还可能与供试病原真菌本身的特性相关，由于供试病原真菌属于不同的种属，决定了它们在生长习性、结构特点等方面有所差异，导致了生防菌在和病原菌互作过程中所表现出的拮抗能力不同。此外，在整体水平上，生防菌菌株ＬＤＢ１液体培养比其固体培养抑菌作用强，这可能与生防菌的作用机制有关。枯草芽孢杆菌主要是通过直接作用和间接作用达到抑制效果，直接作用主要是空间竞争，间接作用则是通过胞外分泌的各种酶和蛋白质。含菌发酵液与固体态菌种均具有空间竞争能力，但是发酵液中已经含有部分胞外分泌的抑菌物质，能够比固态菌种更早发挥抑制作用。本试验只是初步的探索，对于生防菌菌株ＬＤＢ１的具体作用机制及其分泌的抑菌物质的抗菌活性尚有待进一步研究。
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（责任编辑 陈 焰）