本实验主要探究钙与复合氨基酸质量比、pH 值、温度、时间四种因素对螯合率的影响，为阿胶复合氨基酸螯合钙的进一步应用提供技术支持与理论基础。
1 材料与方法
1.1 仪器、试剂及材料
1.1.1 材料鱼骨粉购自青岛佰仁生物科技有限公司；阿胶复合氨基酸粉（实验室自制）。
1.1.2 仪器TG16G 离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；
HH-8 数显恒温水浴锅（金坛市科析仪器有限公司）；
AL204-IC 电子天平（梅特勒- 托利多仪器有限公司），原子吸收分光光度计。
1.1.3 试剂乙二胺四乙酸二钠；CaCO3；钙指示剂；盐酸；硝酸；高氯酸；无水乙醇以上均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 鱼骨粉中钙的水解取鱼骨粉1.00 克，在盐酸用量4 毫升，盐酸浓度3mol/L，反应温度108℃，反应时间1 小时，此条件下鱼骨粉中可溶性钙溶出率最高[3]。
1.2.2 鱼骨粉中可溶性钙含量的测定采用熊竹EDTA 滴定法，配置EDTA 标准溶液与钙标准溶液，用钙标准液标定EDTA 溶液，用配置好的EDTA 标准液滴定样品溶液至溶液呈蓝色。测得可溶性钙含量为28.2%，具有很高的利用价值。可溶性钙含量计算公式[4]：
可溶性钙含量%= 可溶性钙总量/ 骨粉总量×100%
1.2.3 螯合反应将氨基酸液与钙源按一定比例混匀，放入恒温水浴锅中按一定温度搅拌一定时间，反映结束后将样品置于离心机中，离心分离弃去沉淀物，蒸馏后加入无水乙醇纯化，抽滤弃去滤液，将样品置于冰箱中冷冻干燥。
螯合钙测定运用原子吸收分光光度计测定螯合态钙元素的方法，将样品湿法消化后溶于纯水中，将试液置于离心机中10000 转/ 分钟，稀释上清液后可直接用原子吸收分光光度计测定。
螯合率计算，按公式计算[5]：
A=M1/M2×100%
式中：A———螯合率（%）；M1———螯合态钙元素含量（g）；M2———反应体系中钙元素总量（g）。
1.2.4 单因素试验钙与复合氨基酸质量比、pH 值、温度、时间四种因素进行单因素试验。
质量比的影响。固定pH 值为7，反应温度70℃，反应时间50 分钟，分别量取钙与复合氨基酸质量比2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2 制成样品进行螯合反应。
pH 值的影响。固定钙与复合氨基酸质量比1∶1，反应温度70℃，反应时间50 分钟，分别调pH 值为5、6、7、8、9 进行螯合反应。
温度的影响。固定钙与复合氨基酸质量比1∶1，pH 值为7，反应时间50 分钟，反应温度分别为30℃、50℃、70℃、90℃进行螯合反应。
反应时间的影响。固定钙与复合氨基酸质量比1∶1，pH为7，反应温度70℃，反应时间分别为30 分钟、40 分钟、50 分钟、60 分钟、70 分钟进行螯合反应。
1.2.5 正交试验试验采用钙与复合氨基酸质量比、pH 值、温度、时间四个因素设计正交表L9 （34），根据正交分析确定最优螯合路线，见表1。
2 结果与讨论
2.1 单因素试验
2.1.1 钙与复合氨基酸质量比对螯合率的影响
由图1 可知当钙与复合氨基酸质量比为1∶1 时螯合率出现峰值，钙含量较多或较少对螯合率都有影响，其原因可能是氨基酸与钙螯合的比例是一定的，钙离子增加和减少都会对螯合反应造成影响[6]。
2.1.2 pH 值对螯合率的影响由图2 可知，当pH 值为7 时螯合率最高，pH 值过酸过碱都影响钙离子螯合，可能是当溶液中H+ 增加时，H+ 与钙离子争夺供电基团，影响螯合反应的正常进行，当溶液中OH-增加时OH- 与钙离子率先形成氢氧化钙沉淀，不利于螯合反应进行[7]。所以pH 值为7 时，H+ 与OH- 对氨基酸影响较小，螯合率最高。
2.1.3 温度对螯合率的影响
由图3 可知，当温度逐渐升高时螯合也不断升高，温度达到70℃时螯合效果最佳，温度过高螯合率反而下降，其原因可能是过高的温度使螯合物分解或发生其他化学反应，从而使螯合率降低[8]。
2.1.4 时间对螯合率的影响
由图4 可知，当反应时间为50 分钟时螯合效果最佳，时间过长反而使螯合率降低，原因可能是螯合物不稳定，时间过长会造成螯合物分解或转化[9]，从而降低了螯合率。2.2 正交试验（见表2）
3 结论
本研究结果显示：对螯合率的影响，钙与氨基酸比例>反应时间＞pH 值> 反应温度。当钙与复合氨基酸质量比1∶1、pH 值取7、反应温度90℃、反应时间60 分钟的条件下螯合率最高，螯合率达76.5%。与同类文献螯合率结果相差不大，说明鱼骨中钙含量较丰富, 利用鱼骨制备复合氨基酸螯合钙有利于废物利用，减少环境污染。
[1]王俊,程薇,文莉,熊光权,曾汉庭,陈金国,乔宇. 复合氨基酸螯合钙对大鼠生物利用率的研究[J]. 湖北农业科学,2008,(12):1492-1494.
[2]马海霞,杨贤庆,胡振珠,张桢,陈胜军,杨燕.复合氨基酸螯合钙的合成工艺优化[J].食品与机械, 2012,(01):214-218.[3]熊竹.虾粉制备复合氨基酸螯合钙工艺研究[J].农技服务,2016,(05):107+106.
[4]杨贤庆. 复合氨基酸螯合钙抗氧化性研究[A]. 中国水产学会.2010 年中国水产学会学术年会论文摘要集[C].中国水产学会,2011:1.