夏武强,张美珍,刘长军,孙琛,蒋一鸣
（象山县海洋与渔业质量技术检测中心，浙江 象山，315700）
摘要：以NaOH-甲醇溶液为皂化液，采用正交试验方法，对虾青素酯皂化工艺中NaOH浓度、皂化温度和皂化时间3个因素进行最优水平的筛选。经试验确定虾青素酯最佳皂化工艺条件为2.0 g/L的NaOH-甲醇溶液，在15 ℃条件下皂化5 h，虾青素酯达到最佳的皂化效率，样品中游离虾青素含量从皂化前的25.765 μg/mL提高到88.175 μg/mL。
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关键词 ：虾青素；虾青素酯；皂化工艺
虾青素（Astaxanthin），又名虾黄素，虾黄质，化学名3,3´-二羟基-4,4´-二酮基-β,β´-胡萝卜素，化学式为C40H52O4，相对分子质量596.86，其结构式如图1所示[1]。化学结构由4个异戊二烯单位以共轭双键形式连接，两端有2个异戊二烯单位组成的六节环结构[2]，具有很强的抗氧化性，能有效清除体内自由基，增强机体免疫力[3]，同时，具有抗癌、抗高血压、抗衰老、保护视网膜、预防心血管疾病等功能[4]，还能提高鱼类生长速度和繁殖力，改善水生动物及禽类的色泽[5]，广泛应用于食品、药品、保健品和养殖业等行业。
随着虾青素研究和开发应用的不断深入，虾青素含量的测定也越来越受到人们的关注。赵立艳[6]、谢虹[7]、余孔捷[8]等分别建立雨生红球藻、红法夫酵母发酵液和动物性食品中虾青素的检测方法，国家质检总局也于2009年7月发布《进出口动物源性食品中角黄素、虾青素的检测方法》[9]，但由于虾青素在酵母、细菌、植物等中一般以游离虾青素存在，而在海产品、藻类等主要以虾青素酯形式存在[10]，检测过程中只能测定游离虾青素的含量，但不能反映样品中虾青素的真实含量，因此，需要对虾青素酯进行皂化水解。周双林等[11]用KOH-甲醇溶液皂化虾青素酯；齐安翔等[12]用NaOH-甲醇溶液皂化虾青素酯。但由于前者碱浓度较高（10 g/L），容易使虾青素分解，造成检测值偏低，后者皂化时间长（8 h），在实际检测中效率较低，并且都未将过量的碱去除就直接上机检测，影响色谱柱使用寿命及检测稳定性。因此，需要研究一种安全、高效的虾青素酯皂化工艺条件。
本试验以提取好的虾青素油为原料，以虾青素含量为指标，以NaOH浓度、皂化温度和皂化时间为3个实验因素，采用正交试验方法，选择最佳的虾青素酯皂化工艺条件。
1材料与方法
1.1材料与试剂
虾青素标准品，虾青素油，甲醇、二氯甲烷为色谱纯，NaOH为分析纯，水为超纯水。
1.2仪器与设备
高效液相色谱仪（1525泵、2487检测器、717自动进样器、1500柱温箱），C18柱（250 mm×4?6 mm，5 μm），BP221S型电子天平，TDL-5000B冷冻离心机，AWL-1001-U微量无机型超纯水器，SHP-250生化培养箱。
1.3方法
1.3.1虾青素酯皂化
1.3.1.1皂化工艺正交设计以NaOH浓度、皂化温度和皂化时间为3个实验因素，每个因素设计3个水平（详见表1），按L9（34）正交表安排试验。
1.3.1.2虾青素酯皂化称取127mg虾青素油脂，用2 mL二氯甲烷溶解，用甲醇定容至25 mL；分别移取1 mL样品溶液、4 mLNaOH-甲醇溶液至10 mL棕色试剂瓶中，充入氮气，混合均匀，15～25 ℃下皂化反应4～6 h；将皂化液转移至含有5 mL二氯甲烷和5 mL超纯水的50 mL离心管中，混合均匀，4 000 r/min离心5 min，将下层虾青素相转移至容量瓶，用甲醇定容至50 mL；样品过0.22 μm有滤膜，进行HPLC分析。
1.3.2虾青素含量的测定参考周双林[12]的检测方法，并作适当调整。
1.3.2.1色谱条件
色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，柱填料粒径5 μm；
流动相：甲醇∶水=95∶5；
流速：1.0 mL/min；
柱温：室温；
进样量：10 μL；
检测波长：475 nm；
运行时间：15 min。
1.3.2.2虾青素含量测定称取0.001 2 g虾青素标准品，用2.5 mL二氯甲烷溶解，用甲醇定容至25 mL，配制成浓度为48.0 μg/mL的标准溶液；取标准溶液配制成浓度为2.4、4.8、12.0、24.0、48.0 μg/mL的系列标准溶液。标准溶液和样品溶液按1.3.2.1的色谱条件上机分析，记录峰面积，根据标准样品的保留时间定性，外标法定量。
样品中虾青素含量按公式1计算：
X=1250×Cxm（公式1）
X—样品中虾青素含量，μg/mg；
Cx—标准曲线上查得的样品中虾青素浓度，μg/mL；
m—样品重量，mg。
2结果与分析
2.1皂化效果
2.1.1虾青素的标准曲线以虾青素含量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图2所示。标准曲线方程为：
y=69 131.0 x－112 959.6，r2=0.999 8（公式2）
图2虾青素的标准曲线
2.1.2原样品游离虾青素含量未经皂化的虾青素油脂用甲醇稀释后，根据1.3.2测定游离虾青素含量为25.765 μg/mL。
2.1.3正交试验结果根据公式1和公式2计算出各种皂化工艺条件下样品的虾青素含量，结果如表2所示。
试验结果表明，各因素对皂化效果影响顺序为B＞A＞C，虾青素酯最佳皂化条件为A2B1C2，即NaOH浓度2.0 g/L，皂化温度15 ℃，皂化时间5 h。
2.1.4验证试验根据2.3选出的最优工艺条件进行3次验证试验，测定结果见表3。结果表明正交试验优选的皂化条件确实达到最优的皂化效果，且工艺条件稳定、可靠。
2.2样液pH值
皂化反应样液经“水—二氯甲烷”体系重新分配后，用pH试纸测定水相和有机相的pH值。经测定，水相pH值为13，有机相pH值为7。说明“水—二氯甲烷”体系提取有效去除了过量的NaOH，减少样液对色谱柱使用寿命的影响，保证了检测的稳定性。
3结论
本试验以游离虾青素含量为指标，以NaOH-甲醇溶液浓度、皂化温度、皂化时间为试验因素，采用正交试验方法，试验得出虾青素油溶液在加入4倍体积的NaOH-甲醇溶液（2.0 g/L）、皂化5 h（15 ℃）条件下，虾青素酯可达到最佳的皂化效率。游离虾青素含量从皂化前的25.765 μg/mL提高到88.175 μg/mL（验证试验的平均值）。
皂化反应样液经“水—二氯甲烷”体系提取，可立即终止皂化过程，保证皂化时间的准确性。同时有效去除过量的NaOH，减少样液对色谱柱使用寿命的影响，保证检测的稳定性。
本试验首次对已提取好的较高浓度的虾青素油进行皂化工艺的确定，为虾青素油检测提供了理论依据，能有效推进虾青素油检测的标准化建设进程，促进虾青素产业的健康发展。
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