徐金雷 陈熔熔 张 晏 尹争志
（嘉兴学院生物与化学工程学院，浙江 嘉兴 314000）
【摘 要】大肠杆菌O157:H7是一种典型的致病菌，严重感染后会引发败血症、肾功能衰竭等危及生命的并发症，对其进行检测，在食品安全、医疗卫生、环境保护等方面，都具有十分重要的意义。分析和评述了近年来采用免疫传感手段对大肠杆菌O157:H7检测的报道研究，技术主要分为阻抗式、压电式、表面等离子体共振式、酶标式、荧光标记式、电导式、电致发光式，最后对其研究走向和应用前景进行了展望。
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关键词 大肠杆菌O157:H7；免疫传感器；检测；综述
Research Progress of Immune-sensors in Detection of Escherichia coli O157:H7
XU Jin-Lei CHEN Rong-rong ZHANG Yan YＩＮ Zheng-ｚhi
（College of Biological， Chemical sciences and Engineering， Jiaxing University， Jiaxing Zhejiang 314001， China）
【Abstract】Escherichia coli O157:H7 is a kind of typical pathogenic bacteria. Life-threatening complications including hematosepsis， renal failure will be leaded after severe infection. The detection of Escherichia coli O157:H7 have a very important significance in the food safety， medical and health， environmental protection and other aspects. This paper analyzed and reviewed recent reported research for detection of Escherichia coli O157: H7 by immune-sensing means. Immune-technologies mainly divided into impedance type， piezoelectric transducer type， surface plasmon resonance type， enzyme label type， fluorescent marker type， conductometric type， electrochemiluminescence type. Finally， the research study direction and application prospect are looked into the distance.
【Key words】Escherichia coli O157:H7； Immune sensor； Detection； Review
0 引言
大肠杆菌O157:H7对人的致病力较强，每克感染载体含菌10个以上即可能引起感染。严重感染大肠杆菌 O157:H7（Escherichia coli O157:H7，E. coli O157:H7）后，会产生大量的Vero毒素，从而引起出血性肠炎、溶血性尿毒综合症和血栓性血小板减少性紫癜等。因此，对E. coli O157:H7的预防和检测，具有重要的意义。
常规实验室对E. coli O157:H7的鉴定、检测依然停留在分离培养、形态观察、生化鉴定和血清学分型水平，这些传统的方法操作复杂、检测周期较长。免疫传感器是由固定化的生物敏感材料作为识别元件与适当的理化换能器及信号放大装置构成的分析系统。具有特异、灵敏、高效、经济实用等优点，可以在物质分子层面进行快速、微量检测，目前正成为一种强有力的通用分析工具。该文就免疫传感技术在检测E. coli O157:H7方面的最新进展进行简要综述，并展望该技术在致病菌检测方面存在的难点与研究前景，期望对该领域的研究提供一定的参考价值。
1 检测大肠杆菌O157:H7的免疫传感器
１.1 阻抗式
阻抗式免疫传感器是通过检测修饰电极的界面特性来分析样品中E. coli O157:H7的一种方法。Barreiros等以ITO为基底，构建特意识别E. coli O157:H7的传感界面，实现了E. coli O157:H7的特异、灵敏检测。检测线性范围为10~106 CPU/mL，检测限达1 CPU/mL[1]。Wang等使用丝网印刷电极制备了可抛式、简易的E. coli O157:H7阻抗传感器，检测限为1.5×103 CFU/mL，线性范围为1.5×103~1.5×107 CFU/mL[2]。该类方法不需要标记、且传感器制备较简化，而得到广泛研究，但该方法与传统方法相比较其灵敏度偏低，实际样品分析系统有待进一步完善。
1.2 压电式
压电免疫传感器依靠测量质量的变化来实现目标物的测定，即在生物化学反应过程中，压电石英晶体表面被修饰、选择性地与被检测物质作用，继而在晶体表面出现异号极化电荷（又称压电效应），从而实现生物传感器的检测目的。Farka等有机结合石英晶体微天平的有效、被动技术，实现了E. coli的检测，检测限位8×104 CFU/mL[3]。Shen等研发了E. coli O157:H7的一种新型压电检测方法，使用了免疫磁珠技术，检测时间为4小时，在磷酸盐缓冲溶液中的检测限为23 CFU/mL，在牛奶中的检测限为53 CFU/mL[4]。压电生物传感器的特点是样品无需标记、响应灵敏、特异性高、简便快速、易于自动化与集成化。
1.3 表面等离子体共振式
当生物分子结合到金属表面时，会引起表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）折射率及入射角的改变，因此通过监测生物反应过程中SPR角的动态变化，可以得到生物分子之间相互作用的特异性信号，以此来研究生物分子间的相互作用。Tokel等对SPR进行了评述，并用于E. coli的检测，检测线性范围1.0×105到3.2×107 CFU/mL[5]。Usachev等研制的SPR免疫传感器，对溶液中E. coli的检测限为15×103 CFU/mL，对应空气中的含量为219×104 CFU/mL[6]。SPR免疫传感器的研究在生物传感器领域的应用已相对成熟，部分成品仪器已应用到E. coli O157:H7的检测。SPR 技术具有非破坏性、无需标记、实时监测、灵敏度及选择性高的优点；但SPR传感技术对于低浓度、小分子量的分子检测精度不高。
1.4 酶标式
Shen等采用免疫磁珠和细小金纳米粒子构建了增强型酶联免疫检测体系，根据颜色变化，在磷酸盐缓冲溶液中，对E. coli O157:H7的检出限为68 CFU/mL，对食品中E. coli O157:H7的检测线性为6.8×102到6.8×103 CFU/mL，是普通免疫磁珠分离基酶联免疫检出限的两倍，比普通酶联免疫检测灵敏度提高了四倍，整个分析过程在3小时内完成，为一种高效、灵敏的检测方法[7]。Zhag等借助葡萄糖氧化酶、漆酶的双重放大功能，研制了一种灵敏的检测E. coli O157:H7的化学发光免疫传感体系，借助产生的过氧化氢，构建鲁米诺的发光，从而实现对E. coli O157:H7的检测，检测时间小于2小时，线性区间为4.3×103 CFU/mL到4.3×105 CFU/mL，检出限为1.2×103 CFU/mL，具有一定的推广价值[8]。至今，酶标法传感器主要通过两种方式实现，一是酶直接与底物作用产生光学信号，二是借助酶产生的电信号。多数情况下，可以通过直接改变标记底物获得可检测的信号（荧光、化学发光，电信号）。但是，标记酶的稳定性和活性保持能力有待发展，发展人工模拟酶在该领域的应用，也是很好的发展方向之一。
发光检测示意图[8]
1.5 荧光标记式
近年来， 基于荧光标记方法构建的生物传感器广泛应到致病菌的检测中。Chen等以包裹荧光素的硅球为标记，借助荧光显微镜、流式细胞仪构建了E. coli O157:H7的快速间接检测系统，荧光显微镜可以检测到1.0×105 cell/mL 的E. coli O157:H7；流式细胞仪可以检测到混合液中4.5×106 cell/mL 的E. coli O157:H7，并成功应于啤酒中E. coli O157:H7的检测[9]。Cho等借助免疫磁珠技术，实现了E. coli O157:H7、伤寒沙门氏菌、单核细胞增多性李司忒氏菌三种致病菌的原位荧光分别检测，对食物样品中致病菌的检出限都约为5 CFU/mL[10]。荧光标记由于快捷、便利、简单等优势，在E. coli O157:H7的检测应用中，具有较好的发展前景。
1.6 电导式
Sarra等研究了一种基于电导信号的免疫传感器，并成功用于E. coli和粘质沙雷氏菌的检测，检测区别为1到103 CFU/mL[11]。Hnaiein等构件了一种基于免疫磁性粒子的电导式E. coli检测体系，该方法对E. coli具有较好的特异性，1 CFU/mL E. coli的变化可以产生35 mus电导检测信号，检测可达500 CFU/mL[12]。电导式免疫传感器尚处于发展阶段，存在较大的发展空间。
1.7 电致发光式
Leach等采用自动化的电致发光系统实现样品中E. coli O157:H7的检测，经5 h的富集之后，检测灵敏度可以达到0.1 CFU/g，整个实验可以在6.5 小时内完成[13]。目前，电致化学发光的标记物有限，且其稳定性有待进一步改善。
2 结论与展望
抗原-抗体特异识别E. coli O157:H7所建立的传感器，统称为E. coli O157:H7免疫传感器。其两大主要部分就是识别元件和信号传递元件，根据信号源不同，主要分为免标记直接检测型和带标记间接检测型两类。前者简单、花费低，但灵敏度较低，限制了其应用；而后者应用相对较广泛。与其它方法相比，免疫传感器检测E. coli O157:H7还处于起步阶段，但是E. coli O157:H7免疫传感器具备快速、灵敏、便携、易操作的发展前景，决定了其在E. coli O157:H7检测将占有一席之地。
生物传感器作为一种发展中的检测手段，各种分类之间有其相互交叉的地方，因此可以通过不同方法与传感器结合开展研究，将多种方法相互融合、取长补短实现检测的最终目标：高通量、高灵敏、快速便携、易操作。随着分子生物学技术的迅速发展，使得快速、准确检测E. coli O157:H7成为可能，并为该领域的研究开拓更广阔的前景。
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参考文献
［１］Dos Santos M.B.； Azevedo， S.； Agusil， J.P.； et al. Label-free ITO-based immunosensor for the detection of very low concentrations of pathogenic bacteria[J]. Biolectrochemistry， 2015，101:146-152.
［２］Wang Y.X.； Ye Z.Z.； Ying Y.B. Development of a disposable impedance biosensor and its application for determination of Escherichia coli O157:H7[J]. Transactions of the Asabe， 2014，57（2）:585-592.
［３］Farka Z.； Kovar D.； Skladal P. Rapid Detection of Microorganisms Based on Active and Passive Modes of QCM[J]. Sensors， 2015，15（1）:79-92.
［４］Shen Z.Q.； Wang J.F.； Qiu Z.G.； et al. QCM immunosensor detection of Escherichia coli O157:H7 based on beacon immunomagnetic nanoparticles and catalytic growth of colloidal gold[J]. Biosensor & bioelectronics， 2011，26（7）:3376-3381.
［５］Tokel O.； Yildiz U.H.； Inci F.； et al. Portable Microfluidic Integrated Plasmonic Platform for Pathogen Detection[J]. Scientific reports， 2015，5.
［６］Usachev E.V.； Usacheva O.V.； Agranovski I.E. Surface plasmon resonance-based bacterial aerosol detection[J]. Journal of applied microbiology， 2014，117（6）: 1655-1662.
［７］Shen Z.Q.； Hou N.A.； Jin M.； et al. A novel enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Escherichia coli O157:H7 using immunomagnetic and beacon gold nanoparticles[J]. Gut pathogens， 2014， 6， DOI:10.1186/1757-4749-6-14.
［８］Zhag Y.； Tan C.； Fei R.H.； et al. Sensitive Chemiluminescence Immunoassay for E. coli O157:H7 Detection with Signal Dual-Amplification Using Glucose Oxidase and Laccase[J]. Analytical chemistry， 2014，86（2）:1115-1122.
［９］Chen Z.Z.； Cai L.； Chen M.Y.； et al. Indirect immuno uorescence detection of E. coli O157:H7 with uorescent silica nanoparticles[J]. Biosensors and bioelectronics， 2015，66:95－102.
［１０］Cho I.H.； Mauer L.； Irudayaraj J. In-situ uorescent immunomagnetic multiplex detection of foodborne pathogens in very low numbers[J]. Biosensors and bioelectronics， 2014，57:143－148.
［１１］El Ichi S.； Leon F.； Vossier L.； et al. Microconductometric immunosensor for label-free and sensitive detection of Gram-negative bacteria[J]. Biosensors and bioelectronics， 2014，54:378－384.
［１２］Hnaiein M.； Hassen W.M.； Abdelghani A.； et al. A conductometric immunosensor based on functionalized magnetite nanoparticles for E. coli detection[J].Electrochemistry communication， 2008，10（8）:1152－1154.
［１３］Magana S.； Schlemmer S.M.； Leskinen S.D.； et al. Automated dead-end ultrafiltration for concentration and recovery of total coliform bacteria and laboratory-spiked Escherichia coli O157:H7 from 50-liter produce washes to enhance detection by an electrochemiluminescence immunoassay[J]. Journal of food protection， 2013，76（7）:1152-1160.
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