陈倩 杜娜 肖婧珊 李洋 霍盼 李亚
（曲阜师范大学生命科学学院，山东 曲阜 273165）
【摘要】目的：研究急性应激对小鼠空间学习记忆的影响及其机制。方法：以足底电击来建立急性应激小鼠模型，采用Morris水迷宫检测小鼠空间学习记忆能力，以免疫组化方法检测神经营养因子-3（NT-3）在小鼠海马和前脑皮层的表达。结果：水迷宫实验中，急性应激组小鼠与对照组相比，空间学习记忆显著提高（P<0.01）。在海马CA1区、CA3 区、齿状回及前脑皮层NT-3的表达显著增强（P<0.05，P<0.01）。结论：急性应激所致小鼠空间学习记忆功能的提高可能与脑内NT-3表达上调相关。
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关键词 急性应激；学习记忆；神经营养因子-3；海马；前脑皮层
Effects of Acute Stress on Ability of Spatial Learning-Memory and Expression of NT-3 in Mice Brain
CHEN Qian DU Na XIAO Jing-shan LI Yang HUO Pan LI Ya
（College of Life sciences, Qufu normal University, Qufu Shandong 273165, China）
【Abstract】Objective: To study the effects of acute stress on the spatial learning-memory function of mice and its mechanism. Methods: Using acute stress model mice induced by foot shock. The ability of spatial learning-memory of mice were determined by Morris Water maze task, and the expression of nerve neurotrophic factor 3 (NT-3) in the hippocampus (HP) and prefrontal cortex (PFC) were detected by immunohistochemical method. Results: The ability of spatial learning and memory in stress group mice were significantly enhanced (P<0.01), compared with the control group mice. The NT-3 expression in CA1,CA3, DG of HP and PFC were significantly increased in stress group mice (P<0.05, P<0.01). Conclusion: The acute stress causes the improvement of spatial and memory function in mice which may be closely related to the up-regulation of NT-3 expression in brain.
【Key words】Acute stress; Learning and memory; NT-3; HP; PFC
应激（stress）是指机体受到内外环境多种不利因素刺激时，为适应环境所出现的非特异性综合应答反应[1]。机体在应激时产生适应性反应，免疫、神经、内分泌等系统共同参与调节，来应对应激的损害。研究表明，应激对机体的影响是双重的，适度应激提高机体抵抗力和适应力，对机体有利，过强的应激则产生负面效应。中枢神经系统中，海马、前额叶皮层、下丘脑、纹状体及杏仁体等脑区与应激关系密切[2]。应激可引起中枢神经元的形态和功能改变，进而影响学习记忆功能[3]。神经营养因子-3（neurtrophin-3, NT-3）是神经营养因子家族成员，在中枢神经系统广泛分布，其功能涉及神经系统分化及发育方面，参与损伤后修复，可维持神经元的存活和正常功能[4]。本实验研究急性应激模型小鼠空间学习记忆功能的变化以及海马和前额叶皮层NT-3表达的变化，探讨急性应激对小鼠空间学习记忆的影响及其机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
2月龄昆明品系小鼠（清洁级），雌雄各半，体重20±2g，购自山东鲁抗医药动物实验中心。自然昼夜节律光照下，自由饮水，进食，实验人员每日抓捉小鼠使之适应操作。小鼠随机分为对照组和急性应激组，每组12只。
1.2 建立急性应激模型
急性应激组采用足底电击作为单一应激源（电压36V，15s/次，每次持续30s，共30次）。对照组不接受电击，正常状态饲养。
1.3 Morris水迷宫检测学习记忆能力
采用Morris水迷宫，检测两组小鼠的学习记忆能力。Morris水迷宫由圆形水池和池内一可移动平台组成，直径80cm，高50cm，水温26±1℃。测试程序包括定位航行和空间搜索两个实验步骤。水迷宫被均分为4个象限，平台置放于第一象限（目标象限），并在第三象限池壁做红色标记，使之于平台连线为水池直径。定位航行实验共2d，每只小鼠每天两个训练周期，每个周期内接受4次找平台训练，小鼠分别对应一个象限入水，每次训练120s。记录小鼠入水至找到水下平台的逃避潜伏期（escape latency）。第3d进行空间搜索试验，撤除平台，小鼠由第三象限入水点入水，记录小鼠120s内在4个象限的游泳时间，以检测小鼠对平台（目标象限）的记忆能力。在定位航行的每个训练周期前和空间搜索试验前对应激组的小鼠足底电击。
1.4 小鼠海马和前额叶皮层NT-3的表达
在完成水迷宫空间试验后，戊巴比妥钠注射麻醉小鼠，开胸腔暴露出心脏，快速经心先后灌注37℃生理盐水50ml及4℃的4%多聚甲醛溶液50ml，开颅取脑，然后再固定2h，经梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后进行冠状切片（厚约5μm）。然后进行免疫组化实验，一抗及试剂盒均购自武汉博士德生物公司，按照试剂盒的要求操作。阴性对照选择PBS（磷酸缓冲液）代替一抗。选择每只小鼠相应海马部位和前脑皮层（PFC）切片3张，每张随机选取两个不相重叠的视野，用Motic Images Advanced 3.2图像处理系统对海马和前脑皮层的NT-3阳性细胞平均目标灰度值进行分析。
1.5 统计学处理
所有数据以平均数±标准差(x±s)来表示，水迷宫2d定位航行逃避潜伏期采用重复测量方差分析（repeated-measures ANOVA）；第3d空间搜索试验各象限游泳时间采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间比较以 Newman-Keuls法分析。其他数据组间比较用非配对t检验分析。P<0.05时说明有统计学差异。
2 结果
2.1 各组小鼠空间学习记忆功能的变化
统计数据显示，两天的定位航行试验中，对照组和应激组小鼠的逃避潜伏期迅速下降（表1）；有统计学显著性差异（F=6.172，P<0.01）；与对照组相比，应激组在第2、3、4训练周期的逃避潜伏期明显缩短，有显著性差异（P<0.05，P<0.01，P<0.01）。 结果表明，急性应激能明显增强小鼠的空间学习能力。
*P <0.05，**P <0.01：与对照组比较(ANOVA,N-K检验)；n=12.
在空间搜索实验中，在目标象限（第一象限）对照组和应激组小鼠均停留最长时间（表2）；对照组小鼠 （F=10.03，P<0.01）和应激组小鼠（F=20.61，P<0.01） 在目标象限停留的时间均显著长于在二、三、四象限的时间。与对照组比，在目标象限应激组小鼠的停留时间显著延长（P<0.05），而在目标象限的对面象限（第三象限）停留测时间显著减短 （P<0.05） 结果表明，急性应激后小鼠空间记忆保持能力增强。
*P <0.05，与对照组比较(ANOVA，N-K检验)；n=12.
2.2 各组小鼠海马和前脑皮层NT-3蛋白的表达
免疫组织化学染色表明，急性应激后，与对照组小鼠比较，应激组小鼠海马CA1 、CA3 区、 DG 区及前额叶皮层 NT-3的表达显著增强。与对照组比较（表3），应激组小鼠在各脑区的NT-3 阳性神经元平均目标灰度值显著减少（P<0.05）。
*P<0.05, 与对照组比较（非配对t检验）；n=12.
3 讨论
研究表明，应激对机体的影响具有双重性，适度的应激对机体起积极作用，而长久、强烈的刺激使中枢神经元形态改变及功能障碍，影响脑的认知功能，引起学习记忆能力的下降。海马在应激导致行为变化方面发挥重要作用，是学习记忆的关键脑区[5]。英国心理学家Morris设计水迷宫用于学习记忆脑机制研究，能对动物空间学习记忆能力作出较准确的反映。本实验结果显示，急性应激后小鼠在Morris水迷宫中的逃避潜伏期明显缩短，在空间搜索试验中，小鼠目标象限停留时间明显延长，说明急性应激能使动物的空间学习记忆功能显著增强。
NT-3在中枢和外周神经系统广泛分布，主要在海马、脑干、背根节、脊髓等[6]。NT-3的一级结构与NGF家族其他成员有一致的保守区，又有可变区。NT-3主要通过酪氨酸激酶受体（trkC）受体来发挥生物学效应。NT-3生物学效应广泛，在体内能够支持感觉的运动神经元存活，在神经系统发育早期，能够促进神经嵴细胞的发育，对外周感觉神经元的发生及数量起调节作用[7]。NT-3缺乏或表达降低会影响学习记忆等功能，并与神经退行性疾病密切相关。NT-3能阻止老年痴呆患者胆碱能神经元退变，对于基底前脑胆碱能神经元退变导致的学习记忆功能障碍有改善作用。NT-3选择性的结合 trkC受体而发挥生理效应。trkC是 trk受体家族的重要成员，作为NT-3的高亲和力受体，分布在海马的锥体细胞层、齿状回、大脑皮质的外层细胞簇及小脑颗粒细胞层，NT-3也在这些区域表达，提示NT-3与 trkC形成联合自分泌环路，对神经元存活起一定作用[8]。
我们先前的研究表明，急性应激引起小鼠空间学习记忆功能增强，脑内海马和前脑皮层GDNF的表达明显增加[9]。本实验结果表明，急性应激后，应激组小鼠的海马和前额叶皮层NT-3的表达显著增强。结果显示，急性应激使小鼠海马和前脑皮层的神经元活动发生明显变化。海马和前脑皮层与学习记忆功能密切相关，海马更是调节应激反应的高级中枢[10]。急性应激后，小鼠空间学习记忆功能的提高与海马和前脑皮层NT-3表达增强是一致的，结果提示NT-3可能参与调控急性应激对动物空间学习记忆功能的改变，其表达上调可能是导致空间学习记忆功能改变的机制之一。
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参考文献
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［9］陈亚静,史建勋,张冠雄,李亚.急性应激对小鼠空间学习记忆功能及脑内GDNF表达的影响[J].信息科技,2012,6:53-54.
［10］Sapolsky RM.Why stress is bad for your brain[J].Science,1996,273:749-750.
［责任编辑：杨玉洁］