摘要：石油使用量的增大导致石油污染量的增加.为经济有效地修复低污染浓度的石油烃污染土壤，了解蚯蚓对植物去除土壤石油烃的影响，探讨蚯蚓对土壤石油烃污染的修复效应，通过人工制备石油烃污染土壤，采用植物〔紫茉莉(MirabilisjalapaL.)、凤仙花(ImpatiensbalsaminaL.)、西伯利亚鸢尾(IrissibiricaL.)〕以及植物-蚯蚓〔赤子爱胜蚓(Eiseniafoetda)〕两种处理模式进行60d的盆栽试验，通过测定土壤中w(石油烃)、过氧化氢酶和多酚氧化酶的活性变化来解析蚯蚓对植物修复土壤石油烃效率的影响.结果表明：相同处理条件下，凤仙花、紫茉莉与西伯利亚鸢尾土壤中石油烃去除率分别为36.32%、32.70%、29.82%，凤仙花的土壤修复效果最佳.添加蚯蚓后，对应凤仙花、紫茉莉与西伯利亚鸢尾土壤中石油烃的去除率分别为40.73%、36.10%、32.80%，显著高于未添加蚯蚓土壤，表明添加蚯蚓能够促进植物对土壤中石油烃的修复效果.土壤修复过程中过氧化氢酶与多酚氧化酶活性总体呈上升趋势，添加蚯蚓对土壤酶活性具有刺激作用.土壤中过氧化氢酶、多酚氧化酶活性均与w(石油烃)呈显著负相关(相关系数分别为-0.79和-0.90，P均小于0.05)，说明土壤中过氧化氢酶与多酚氧化酶可能参与了土壤中石油烃的降解过程.研究显示，蚯蚓能够强化植物对石油污染土壤的修复效果，为植物width=4，height=9，dpi=110蚯蚓联合修复石油污染土壤提供了技术依据.
关键词：石油烃；植物；蚯蚓；土壤酶；去除率
作者：李彤1，2，李翔2*，李绍康2，杨津津2，余红2，席北斗1，2*
1.桂林理工大学环境科学与工程学院，广西桂林5410042.中国环境科学研究院，北京100012
石油开采运输过程中不可避免地会出现跑冒滴漏现象，造成大面积环境污染问题的发生[1].据统计，我国每年有超过60×104t的原油进入生态环境，大约7×104t落地油会进入土壤[2].石油中的多环芳烃、硫化氢、苯等有毒物质通过吸入、误服及皮肤接触等途径进入人体，产生急性或慢性中毒，并且煤油、柴油等低毒性燃料也会对人体产生刺激、麻醉腐蚀甚至致癌作用[3].石油类污染物进入土壤环境后，有机碳含量增加，刺激了自养型微生物大量增加，其中嗜烃微生物能对土壤中的硝态氮等营养元素进行固定，造成营养供应的缺乏[4].土壤为污染物的最终归属，如何解决土壤石油污染问题已经成为急需解决的问题.
植物对大面积轻度污染的场地具有一定的修复潜力[5].野生花卉不仅具有修复成本低、无二次污染的特点，同时还具有一定的经济效应，大量的野生花卉植物已作为污染场地的修复工具进入人们的视野[6].焦海华等[7]研究显示，紫茉莉的生长能够影响土壤微生物结构并提高石油烃的降解速率；王亚男等[8]认为，鸢尾具有修复石油烃含量较高污染土壤的能力.然而大多数具有修复效果的植物均受到生物量小和生长速度缓慢的限制[9].蚯蚓作为土壤中广泛存在的分解者，具有改良土壤结构、促进植物生长的作用[10]，其肠道的消化过程也可能提高土壤酶活性；蚯蚓粪中含有大量的速效养分能够促进微生物生长，因此一直被作为动物修复的主要工具得到深入研究[11-12].Ameh等[13]发现，添加蚯蚓会影响废旧机油污染土壤的生物修复，土壤的生物修复速率随蚯蚓数量的增加而增加；Ekperusi等[14]试验发现，Hyperiodrilusafricanus可有效降低尼日利亚尼日尔三角洲的中度石油污染土壤中石油烃含量.可见，蚯蚓自身对污染物也具有一定的处理效果.
添加蚯蚓对植物修复石油烃污染土壤的研究鲜有报道.该研究以赤子爱胜蚓、紫茉莉、凤仙花和西伯利亚鸢尾为试验材料.通过盆栽试验研究在有无蚯蚓作用下土壤石油烃去除率与土壤酶活性的变化，分析污染土石油烃去除率与土壤酶活性之间的相关性，对比研究蚯蚓活动对植物修复的影响，以期为蚯蚓-植物联合处理石油污染土壤提供技术依据.
1材料与方法
1.1试验材料
所用土壤来自北京顺义农田土壤，将采集的土壤去除杂物，自然风干后研磨过2mm筛备用.供试土壤pH为7.42，w(有机质)为12.03gwidth=5，height=11，dpi=110kg，w(TN)为0.52gwidth=5，height=11，dpi=110kg，w(TP)为3.34gwidth=5，height=11，dpi=110kg.
所用植物紫茉莉(MirabilisjalapaL.)、凤仙花，(ImpatiensbalsaminaL.)、西伯利亚鸢尾(IrissibiricaL.)花苗均购自北京花卉种植基地.所用蚯蚓为赤子爱胜蚓(Eiseniafoetda)，购自三河沃龙蚯蚓养殖厂.选择长势相近的蚯蚓，体质量在300～400mg之间，具有环节的成熟蚯蚓.在无光条件下清肠24h，选取清肠后依然健康的蚯蚓作为供试蚯蚓.
1.2试验设计
盆栽试验在温室下进行，温度保持在25～35℃，试验周期为60d.试验共设2个处理：①植物组(Z)，包括西伯利亚鸢尾(Z1)、凤仙花(Z2)、紫茉莉(Z3)；②植物-蚯蚓组(ZE)，包括西伯利亚鸢尾-蚯蚓(Z1E)、凤仙花-蚯蚓(Z2E)、紫茉莉-蚯蚓(Z3E).同时设置CK组(无蚯蚓与植物).每个处理均设3个重复.
将一定量大庆油田原油溶解至石油醚中，与供试土壤充分混合，待石油醚完全挥发后多次搅拌混匀并稳定2个月后，得到人工石油污染土壤，其中w(石油烃)为(16.7±0.2)gwidth=5，height=11，dpi=110kg.将植物幼苗移栽至装有3kg污染土壤的花盆(直径250mm，高180mm)中，减苗后，西伯利亚鸢尾保留2棵，凤仙花和紫茉莉均保留4棵.ZE组每盆加15条蚯蚓[15].土壤的田间持水量维持在50%左右(称重补水法).
1.3样品的采集与测定
分别于第0、12、24、36、48、60天采集土壤样品40g装于自封袋中，于-40℃下冷冻保存.
准确称取10g污染土壤于50mL离心管中，选取二氯甲烷作为提取液，在室温下加入20mL二氯甲烷后，超声提取两次(25W，时间为15min)，在4000rwidth=5，height=11，dpi=110min下离心5min，合并上清液后，利用水浴54℃下挥发溶剂，然后用石油醚定容至25mL.利用紫外分光光度计(UV-2802型，上海尤尼柯仪器有限公司)测定225nm波长处溶液的吸光度.利用标准曲线计算石油残余浓度[16-17].
采用紫外分光光度法测定土壤中多酚氧化酶的活性：称取1g土样于50mL容量瓶中，加入1mL1%的邻苯三酚溶液后，30℃下水浴2h，取出后加入4mL柠檬酸-磷酸缓冲溶液与35mL乙醚，摇晃数次后萃取30min，所得溶液在430nm处进行吸光度测定.
过氧化氢酶活性的测定：称取2g土样于锥形瓶中，加入40mL蒸馏水以及5mL0.3%的过氧化氢溶液，在振荡机上振荡20min，取下后迅速加入1mL铝钾矾，过滤，然后加入盛有5mL1.5molwidth=5，height=11，dpi=110L硫酸的锥形瓶中.滤干后在240nm处测定溶液的吸光度[18-19].土壤中石油烃的质量分数与其去除率等的差异性分析均采用单因素方差分析法(ANONA)进行.
2结果与讨论
2.1不同植物对土壤中石油烃残余量的影响
3种植物经60d种植后，土壤中w(石油烃)变化如图1所示.由图1可见，0～12d内各处理组土壤中w(石油烃)之间无显著差异(n=12，P>0.05)，土壤中w(石油烃)均无明显变化，这可能是因为修复初期植物幼苗处于适应期，石油污染物对植物主要起抑制作用，石油烃去除可能主要来源于自然挥发、光解以及土著微生物[12]；第24天时，Z1、Z2组土壤中w(石油烃)分别为15.50、14.86gwidth=5，height=11，dpi=110kg，与CK间差异显著(n=12，P<0.05)；第36天时，Z3组土壤中w(石油烃)也显著下降，可能是因为植物逐渐适应了污染环境，通过强化土著微生物、植物累积等途径加快了土壤中石油烃的去除[4]；修复后期，土壤中w(石油烃)基本保持CK>Z1>Z3>Z2的变化趋势；第60天，CK、Z1、Z2、Z3组土壤中w(石油烃)分别为15.32、11.84、10.73与11.31gwidth=5，height=11，dpi=110kg，对应石油烃去除率分别为8.49%、29.82%、36.32%、32.70%.其中，Z组土壤石油烃去除率比对照组高出2.5～3.3倍，说明西伯利亚鸢尾、紫茉莉、凤仙花均能够降低土壤中w(石油烃)，且不同植株的降解效果不同.其中，凤仙花呈现出相对较高的降解能力，紫茉莉次之，西伯利亚鸢尾相对较差.Anderson等[20]研究表明，根际作用是生物降解的主要方式.试验发现，紫茉莉根系的生长较鸢尾与凤仙花生长更为迅速，试验后期逐渐遍布整个花盆，凤仙花次之，而鸢尾属于块根，生长最为缓慢.
2.2蚯蚓对植物处理石油烃的影响
由图2可见，处理第60天时，Z1、Z2、Z3组土壤中石油烃去除率分别为29.82%、36.32%、32.70%，Z1E、Z2E、Z3E组土壤中石油烃去除率分别为32.80%、40.73%、36.10%，添加蚯蚓的植物盆栽与单植株土壤中石油烃去除率之间差异显著(n=30，P<0.05).与单植物相比，添加蚯蚓后西伯利亚鸢尾、凤仙花与紫茉莉土壤中石油烃去除率分别提高了6.52%、9.08%和9.39%.相同条件下，Z组和ZE组土壤中石油烃去除率的差异反映了蚯蚓对石油烃的影响效果.试验结果证明，蚯蚓的参与能够显著提高植物对土壤中石油烃的处理效率，且蚯蚓对紫茉莉降解石油烃效率的影响最大，凤仙花次之，西伯利亚鸢尾相对较差.
植物-土壤系统中根际作用是污染物降解的主要方式[21]，植物可通过增加土壤中微生物活性来提高污染物降解程度[22-23].蚯蚓在土壤中的活动代谢能够增加土壤中含氧量与肥力，提高植株生物量与土壤微生物的代谢商，使得土壤中活性微生物数量增加且年轻化，从而促进土壤中污染物降解效果[24].由图2可见，盆栽植物种类不同，添加蚯蚓对土壤中石油烃去除效果影响也不同，这可能由于凤仙花与紫茉莉生物量相对西伯利亚鸢尾较大，所以蚯蚓对其影响效果相对较小，蚯蚓对植物降解石油烃效果的影响程度也说明在污染物修复中植物为主要动力.
2.3添加蚯蚓对土壤酶活性的影响
试验不同阶段土壤中多酚氧化酶活性测定结果如图3所示.由图3可见，随着修复时间的延长，Z1、Z2、Z3组土壤中多酚氧化酶活性均呈先升后降的趋势，但各组的下降趋势略有不同.与多酚氧化酶活性初始值相比，第60天时各组土壤多酚氧化酶活性均相对增加.Z2组多酚氧化酶活性最高值出现在第36天，为0.57Uwidth=5，height=11，dpi=110g，而Z1与Z3组均在第48天达到最高值，分别为0.58与0.54Uwidth=5，height=11，dpi=110g；ZE组与Z组土壤多酚氧化酶活性变化趋势基本一致，第60天时Z1E、Z2E、Z3E组土壤中多酚氧化酶活性分别为0.58、0.55与0.54Uwidth=5，height=11，dpi=110g，添加蚯蚓后西伯利亚鸢尾、凤仙花与紫茉莉土壤中土壤过氧化氢酶活性分别提高了2.06%、10.13%与3.72%，表明蚯蚓可提高土壤中多酚氧化酶活性.
原油本身含有种类丰富的酚类物质，在其降解代谢过程中也会产生一定量的酚类物质刺激微生物产生多酚氧化酶[25].土壤中酚的含量直接关系到多酚氧化酶活性[26]，其活性的强弱可以直接用来表征部分石油烃的生物降解状况[27].修复初期，土壤中多酚氧化酶活性的提高可能是因为，与多酚氧化酶相关的微生物以石油作为底物，促进了石油烃的降解，酚类物质的大量累积刺激了酶活性的增加，而酚类物质累积达到一定量时，会对植物以及土壤微生物产生毒害作用[28]，降低土壤多酚氧化酶的活性.土壤中w(石油烃)与多酚氧化酶之间的相关性结果表明，修复过程中土壤多酚氧化酶活性与w(石油烃)呈负相关，相关系数为-0.79(P<0.05)，说明多酚氧化酶可能参与了土壤中石油烃的降解过程.
不同处理方式对土壤中过氧化氢酶活性的影响如图4所示.由图4可见，随着修复时间的延长，各处理下土壤过氧化氢酶活性均呈逐渐增大的趋势.修复后期Z组中不同植物修复土壤中过氧化氢酶活性均较对照组有不同程度的增加(0.90～1.24倍)，其中，Z3组中土壤过氧化氢酶活性最高.Z1、Z2、Z3组土壤过氧化氢酶活性分别为1.29、1.03、01.19Uwidth=5，height=11，dpi=110g，Z1E、Z2E、Z3E组土壤中过氧化氢酶活性分别为1.36、1.14、1.28Uwidth=5，height=11，dpi=110g.与单植物相比，添加蚯蚓后种植西伯利亚鸢尾、凤仙花与紫茉莉土壤中过氧化氢酶活性提高了4.60%、11.04%、7.80%，表明添加蚯蚓可提高Z组土壤中过氧化氢酶活性.
土壤酶直接或间接地参与土壤中污染物的降解，其活性是污染土壤生态毒理学的重要指标之一[29]，测定土壤酶活性对了解污染物的去除具有重要意义.过氧化氢酶作为生物体内主要的活性防御系统之一，在污染物胁迫作用下，能够破坏对生物体产生毒害作用的过氧化氢，对土壤系统的物质循环起着重要作用[30].该试验中Z组和ZE组土壤中酶活性变化趋势相似，在Z组中加入蚯蚓均提高了土壤中酶的活性，这可能与蚯蚓的活动及代谢提高了土壤中微生物活性及土壤质量，从而促进植物与土壤微生物分泌更多的酶到土壤环境中[31].土壤过氧化氢酶活性与w(石油烃)之间的相关系数为-0.90(P<0.05)，过氧化氢酶活性与w(石油烃)呈显著负相关，说明土壤中过氧化氢酶可能参与了土壤中石油烃的降解.张秀霞等[32]研究发现，土壤中微生物可以将一定量的石油烃底物作为碳源，同时被与过氧化氢酶相关的微生物利用，从而使过氧化氢含量降低、酶活性增强.
3结论
a)西伯利亚鸢尾、凤仙花和紫茉莉均具有较强的修复石油污染土壤能力，但修复能力各不相同.凤仙花对土壤中石油烃的降解效果最好，紫茉莉次之，西伯利亚鸢尾相对较差；添加蚯蚓能够显著提高土壤中石油烃的处理率，但植物依然是修复的主要动力.
b)植物修复能显著影响土壤酶的活性，土壤过氧化氢酶、多酚氧化酶活性均与w(石油烃)呈显著负相关，说明这两种酶很可能参与了土壤中石油烃的去除，添加蚯蚓能够促进处理体系中的过氧化氢酶和多酚氧化酶的活性，在一定程度上促进土壤石油烃的去除.