Caco-2细胞缺氧复氧损伤时母乳对促炎细胞因子表达的影响

Caco-2细胞缺氧复氧损伤时母乳对促炎细胞因子表达的影响

王宇军 阮为勇 冯伟伟 步伟全 毕明远

南京中医药大学，江苏南京 210028

[摘要] 目的 研究母乳对坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis， NEC）炎症细胞的分子保护机制。 方法 通过建立Caco-2细胞缺氧复氧损伤模型，向正常细胞和缺氧复氧损伤模型细胞分别加入常规培养液、未加热乳清、加热灭活乳清。继续培养6 h后用ELISA法检测Caco-2细胞分泌于培养液中的促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。 结果 正常细胞组，未加热乳清和加热灭活乳清均可下调IL-1β、IL-6水平，未加热乳清较加热灭活乳清下调明显，两者之间差异有统计学意义；缺氧复氧损伤后IL-1β、IL-6、TNF-α均明显表达，未加热乳清和加热灭活乳清均可下调IL-1β、IL-6、TNF-α水平，差异有统计学意义，未加热乳清较加热灭活乳清下调IL-1β明显。 结论 母乳上清液可下调Caco-2炎症细胞促炎细胞因子IL-1β、IL-6的表达，尤其缺氧复氧损伤后TNF-α也下调明显，此类机制可能为母乳防治NEC的作用机制之一。

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关键词 坏死性小肠结肠炎；母乳；IL-1β；IL-6；TNF-α

[中图分类号] R5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１5）02（a）－０001-03

[基金来源] 江苏省中西医结合医院基金（RC1102）。

[作者简介] 王宇军（1975.1-），男，江苏南京人，本科，副主任医师，研究方向：小儿内科。

[通讯作者] 阮为勇，男，主任医师，研究方向：中西医结合小儿急救，邮箱：wyruan@126.com。

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis， NEC）是新生儿尤其是早产儿时的严重胃肠道疾病，预后差，国内该病的病死率为10% ~50%[1]。研究证实，细胞凋亡是NEC早期肠上皮细胞死亡的主要形式，是NEC进一步发展的必经阶段[2]。肿瘤坏死因子-α、脂多糖内毒素、血小板活化因子等在NEC的发病中起重要作用[3]。尽管目前对NEC发病机制研究取得很大进展，但分子生物学机制还没完全阐明，缺乏特效的治疗手段[4]。本实验旨在通过母乳[5]干预Caco-2细胞缺氧复氧损伤， 研究其促炎细胞因子表达情况，探讨母乳防治NEC的作用机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 母乳成份上清液的提取

生后2~4 d的母乳(来自该院产科2012年6月—2013年12月正常分娩产妇)存于 4 ℃ 冰箱， 在24 h内处理， 12 000 r/ min离心10 min去除脂肪成分和细胞碎片， 保留乳清（未加热乳清）用于实验，通过煮沸5 min以灭活热敏感蛋白或多肽，再次12 000转/min离心10 min获得上清液为灭活乳清，未加热乳清和灭活乳清均存于-20 ℃ 冰箱备用。

1.2 Caco-2细胞培养

Caco-2细胞（细胞株购自中科院上海细胞库）适宜在37 ℃、5% CO2和90%相对湿度的环境中培养，采用DMEM培养基，包含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺和青霉素-链霉素双抗液。细胞培养在75 cm2培养瓶中，每5 d按1∶3的比例传代，传代后6~7 d细胞生长达到融合。

1.3 Caco-2细胞缺氧复氧损伤模型的建立

取传代后第6天生长达到融合的Caco-2细胞，吸去90%的培养液，以减少气体弥散距离，剩余培养液能维持细胞存活。将其置入密闭容器中，负压抽吸其中空气，换入高纯氮气，密闭后置入培养箱中孵育90 min(缺氧)，再取出，加培养液至原量，置入培养箱中孵育30 min(复氧)[6]。

1.4 实验分组

Caco-2细胞接种于6孔板，接种密度1×105/孔。分为正常细胞组和缺氧复氧损伤细胞组两大组，每组均分小组：A组为常规培养液组(MEM)；B组为未加热乳清组（以上制备的5% 乳清5%BM），C组为灭活乳清组（煮沸过的5%乳清5%BMb）。继续培养6 h后用ELISA法检测Caco-2细胞分泌于培养液中的促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.5 统计方法

该研究数据采用spss 21.0软件包进行处理，计量资料采用均值±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，组内比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD法。

2 结果

与MEM正常细胞组相比，MEM缺氧复氧损伤组IL-1β、IL-6、TNF-α均明显表达，（t=16.112、9.468、6.593，P＜0.05）；正常细胞组中：单因素方差分析，IL-1β、IL-6表达均较常规培养液组有，差异有统计学意义（P＜0.05），TNF-α下降差异无统计学意义（P＞0.05），LSD法进一步两两比较，BM组IL-1β下降较BMb组更多，差异有统计学意义（P＜0.05），BM组和BMb 组IL-6差异无统计学意义（P＞0.05）。缺氧复氧损伤细胞组中：单因素方差分析，IL-1β、IL-6、TNF-α表达均较MEM组差异有统计学意义（P＜0.05），LSD法进一步两两比较，BM组IL-1β下降较BMb组更多，差异有统计学意义（P＜0.05），BM组和BMb 组之间的IL-6、TNF-α下降差异无统计学意义（P＞0.05）。Caco-2细胞分泌于各培养液中的促炎因子水平比较，见表1。

3 讨论

新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）是新生儿尤其是早产儿常见的消化道危急重症，其诊断和治疗仍然面临很多困难。迄今为止，NEC的病因及发病机制尚未完全明确，目前认为是由于早产、缺氧、低体温、喂养不当、肠道缺血、感染等多种因素综合作用所致。母乳喂养是一个保护因素，据报道人工喂养儿比母乳喂养儿NEC的发病率明显提高，因母乳含有多量的表皮生长因子等，能有效预防发生坏死性小肠结肠炎[7]。该实验中，体外培养了与人肠上皮细胞生物学功能相似的人结肠腺癌细胞系，从细胞及分子生物学水平进一步探讨母乳防治NEC的有效性及具体作用机制。

Caco-2细胞来源于人体结肠腺癌细胞，同源性好。由于Caco-2细胞在培养条件下可自发进行上皮样分化并可形成紧密联结，其形态学、标志酶的功能表达及渗透特征与小肠类似，可以作为研究小肠表皮细胞的药物转运、吸收和代谢的体外模型。因而被国内外大多数实验采用。

细胞因子是指主要由免疫细胞分泌的小分子多肽，具有介导和调节免疫、炎症和造血过程的功能，对机体感染、免疫应答、炎症以及创伤具有重要的调节作用。促炎细胞因子主要有IL-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ等。肠缺血/再灌注损伤是肠粘膜屏障功能损伤的常见原因，已经证实，缺血/再灌注可激活内皮细胞，引起局部细胞因子网络的失衡及某些细胞因子、粘附分子的过度表达，从而引起白细胞介导的组织损伤[8]。该实验缺氧复氧损伤细胞组促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α均明显表达，与文献报道一致，进一步证实细胞因子网络的失衡与NEC发病机制有关。

前期实验中，1%和5%母乳上清液对Caco-2炎症细胞均有抑制作用，后者作用略为明显，但差异无统计学意义（P>0.05），该实验综合考虑选择5%母乳上清液作为实验用浓度。正常细胞组，未加热乳清和加热灭活乳清均可下调IL-1β、IL-6水平，但下调TNF-α差异无统计学意义，未加热乳清较加热灭活乳清下调IL-1β明显，差异有统计学意义；缺氧复氧损伤细胞组，未加热乳清和灭活乳清均可下调IL-1β、IL-6、TNF-α水平，具有统计学意义，未加热乳清较加热灭活乳清下调IL-1β更明显，差异有统计学意义。说明母乳可下调Caco-2炎症细胞促炎细胞因子（IL-1β、IL-6）的表达，尤其缺氧复氧损伤后下调均有统计学意义（IL-1β、IL-6、TNF-α），进一步证明此机制可能为母乳防治NEC的作用机制之一。母乳含有多种有生物学作用的有效成分，加热灭活热敏感蛋白或多肽可能影响这些成分的生物学作用，与未加热乳清比较，对IL-1β部分影响的差异有统计学意义，可能与采用的浓度相关，今后的研究可关注浓度含量的影响[9]。

NEC的发病机制复杂，研究表明可能与Toll样受体（Toll-like receptor， TLR）、核转录因子信号传导的异常激活等相关[10]。对细胞因子调控的分子机制，如母乳对肠上皮细胞核转录因子、Toll样受体表达如何影响，正在系列研究中将作进一步探讨。

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参考文献

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（收稿日期：2014-10-21）