摘要：眼底新生血管是常见的致盲原因,近年来对新生血管抑制剂进行了多方面研究,生物靶向抑制剂成为研究热点。本文从血管内皮生长因子抑制剂、Apelin/APJ通路相关抑制剂和配体组学技术这三方面在抗新生血管中的应用进行综述,使眼科医师对该领域目前研究现状有所了解。
关键词：眼底新生血管 血管内皮生长因子 Apelin 配体组学
眼底新生血管属于异常的血管增殖，是致盲的一个重要原因。新生血管形成过程与多种因素相关，新生血管发生机制目前尚不明确，对于新生血管治疗主要集中于新生血管抑制剂的研究。近年来，生物靶向抑制剂作为一种新兴的治疗方法，在抑制新生血管生长、降低视网膜中央厚度和改善视力等方面有较好的疗效[1-2]。
1 血管内皮生长因子相关抑制剂
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对血管的发育至关重要,并且能刺激血管的生成[3]。VEGF是一个家族,包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、 胎盘生长因子-1(placental growth factor 1,PIGF-1)和PIGF-2。目前已经确定的VEGF的2种酪氨酸激酶(protein tyrosine kinasestyrosine,PTK)受体包括VEGF受体1 (vascular endothelial growth factor receptor 1,VEGFR1)和VEGFR2,VEGF的生物学功能主要是通过VEGFR2来介导[3],VEGF与VEGFR2结合导致VEGFR2的酪氨酸自磷酸化,随后几种关键的衔接蛋白被激活和募集,包括Shc、Grb2、Gab1、SHP1和SHP2[4-6]。衔接蛋白的激活促进下游关键信号的级联,诱导多种与血管生成相关的基因转录。VEGF的过度表达与包括肿瘤生成、急/慢性炎症、增生性视网膜病变在内的病理性血管生成密切相关[3]。VEGF促进内皮细胞的存活、增殖、迁移和侵袭[7-8]。VEGF已被证实是视网膜血管生成疾病的主要致病因子和治疗靶点之一[9],通过阻断VEGFR可以抑制血管细胞间黏附分子-1的表达、白细胞瘀滞及内屏障破坏,减少血管渗漏及新生血管形成。目前临床上已经上市的药物包括贝伐单抗、雷珠单抗、阿柏西普和康柏西普等。玻璃体内注射VEGF抗体(贝伐单抗或雷珠单抗)对治疗眼底新生血管有明显疗效[10-11]。贝伐单抗和雷珠单抗均为完全性抗VEGF-A免疫球蛋白,雷珠单抗为重组人源化单克隆抗体片段,是人类VEGF亚型单克隆抗体片段的重组体,能与人类VEGF-A所有亚型直接特异性结合,从而使VEGF-A亚型无法与其受体结合而达到血管渗透性降低、抑制新生血管的效果[12]。贝伐单抗是一种完整重组人类单克隆抗体,由93%人源IgG1框架区和7%鼠单克隆抗体的抗原结合互补区组成,通过抑制VEGF-A的所有亚型达到抑制新生血管的生成[13]。阿柏西普全部是人的氨基酸序列的融合蛋白组成的VEGF拮抗剂,包含了人VEGF受体-1和人VEGF受体-2的关键结构域,与人免疫球蛋白G1的Fc片段形成融合蛋白,主要结合VEGF-A、VEGF-B和PIGF来发挥拮抗作用[14],从而抑制新生血管的生成。与阿柏西普相比,康柏西普多出一个低电位VEGFR-2结合域,通过结合VEGF-A、VEGF-B、PIGF来使血管内皮的增殖和血管的新生受到抑制。
已有研究证明GAI蛋白是G蛋白的抑制亚基,GAI蛋白与G蛋白受体结合能够抑制腺苷酸环化酶,从而导致环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)生成减少[15]。Sun等[16]发现,GAI1和GAI3的敲除或其短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的敲低均显着抑制VEGFR2信号转导。在机制上,其发现GAI1和GAI3是VEGF诱导的VEGFR2内吞作用必需的,已知VEGFR2的内吞作用是VEGFR2信号转导必不可少的,抑制VEGFR2内吞复合物将抑制VEGF介导的信号转导和血管生成[17-18]。GAI1/ 3的消耗、敲低或突变会破坏VEGF诱导的VEGFR2内吞作用复合物形成。此外,GAI1/ 3沉默也会抑制VEGF诱导的VEGFR2内吞作用、VEGF诱导的体外和体内血管生成以及HUVEC的增殖、迁移、侵袭和血管样管形成。因此,GAI1和GAI3可能是通过促进VEGFR2内吞作用而在VEGF信号转导中的重要参与者。重要的是,GAI1和GAI3在增殖性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者的增殖性视网膜组织中上调,并且它们的上调与蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)-S6K1和细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)的过度激活相关。在高氧诱导的视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR)和碱烧伤诱导的新血管形成的动物模型中,GAI1和GAI3SHRNA或敲除显着抑制体内血管生成。因此根据目前的研究,可以认为抑制内皮细胞中的GAI1和GAI3可为治疗PDR和其他增殖性视网膜疾病提供一种新方法,并且从VEGFR2信号转导的潜在机制方向来思考对于开发新的和有效的治疗策略。
此外,Src也是血管生成信号级联中的关键组分,Src是一种非受体酪氨酸激酶,可与多种细胞表面受体相互作用,并且在细胞生长、分化和迁移的信号转导中起关键作用。Eliceiri等[19]VEGF介导的血管生成需要Src激酶活性。Src在人类多种肿瘤中的活性和表达水平快速升高,在促进肿瘤生长和转移中起重要作用。此外, Src也在病理性眼部新生血管形成中异常激活[20]。通过Src抑制剂可以明显抑制血管的高通透性[21]。研究发现Src在病理性视网膜前血管簇和神经节细胞层中高度活化[22]。这些数据表明Src是参与异常视网膜新血管形成的重要血管生成信号分子。达沙替尼最初是作为Src和BCR/ABL的双重抑制剂开发的,现已被用作对伊马替尼耐药的慢性髓性白血病的有效治疗剂。Seo等[23]使用Src抑制剂达沙替尼来检测其对病理性视网膜新生血管的抑制作用,结果显示达沙替尼完全阻断了VEGF诱导的HRMEC中Y416上Src的磷酸化。鉴于VEGF在病理性眼部新血管形成中的重要性以及Src在VEGF血管生成信号转导途径中的关键作用,用Src抑制剂减弱VEGF诱导的血管生成可能是调节多种眼部疾病中过度新血管形成的良好治疗策略。
目前已知在体内,人绒毛促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)与黄体生成素(luteinizing hormone,LH)相同的受体均具有强烈的促血管生成作用。HCG是一种VEGF调节激素,通过它上调VEGF表达刺激妊娠子宫的血管形成。目前已有研究表明LH/HCG受体存在于视网膜中,并且在眼内均发现了HCG和LH[24]。Movsas等[25]通过实验发现HCG可能影响视网膜血管形成和VEGF产生,因此,HCG受体可能成为潜在的血管增生性视网膜病症的治疗靶向目标。
2 Apelin/APJ通路相关抑制剂
Apelin是一种从牛胃中提取出来的肽类生长因子,为APJ受体的内源性配体[26],以高亲和力与APJ受体结合。Apelin编码77个氨基酸的前原蛋白可产生多种活性多肽,其中Apelin-13是APJ最有效的激活剂。发育研究表明,Apelin在人体包括内皮细胞和血管平滑肌细胞在内的多种细胞中高表达,缺氧可以诱导Apelin-13的表达,缺血组织内皮细胞Apelin和APJ表达增加。虽然大多数研究都集中在Apelin的心血管作用上,但已有研究探讨了它在眼生理和病理血管生成中的作用[27-28]。Apelin增强视网膜内皮细胞的迁移、增殖和毛细血管样管形成,但不增强脐静脉内皮细胞的增殖。在体内,Apelin有助于视网膜血管化和正常的眼部发育以及病理性血管生成[29]。 尽管Apelin/APJ促进视网膜血管生成的详细过程尚不清楚,有研究认为Apelin-13是通过PI-3K-AKT和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/ERK信号通路在糖尿病性黄斑水肿中早期启动细胞骨架和紧密连接[30],并且已有研究证明Apelin/APJ系统通过离散机制与VEGF协同作用促进血管发育[31]。
有研究通过细胞的高通量筛选,发现抗疟药物阿莫地喹和以4-氯氨基喹啉为代表的相关化合物是APJ有效的选择性拮抗剂[32]。阿莫地喹是一种选择性、非竞争性APJ拮抗剂,以浓度依赖性方式抑制Apelin信号转导。此外,阿莫地喹抑制了Apelin和VGEF诱导的内皮管形成。玻璃体内注射阿莫地喹显着降低小鼠模型中的脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)损伤体积,并且在最高测试剂量下未显示出眼毒性的迹象。Ishimaru等[33]比较了OIR小鼠模型中APJ抑制剂和VEGF阻断对病理性视网膜血管生成的影响。他们发现AP2拮抗剂ML221阻止了新生血管簇的形成并且加速了无血管区域的血运重建。相比之下,VEGFR2抑制剂SU1498抑制新生血管簇的形成但不影响无血管区域,提示VEGF-VEGFR2轴不仅在病理性血管生成,在OIR中正常脉管系统的再生也起重要作用。而APJ在新生血管丛中的内皮细胞中高度表达,在形态正常的血管中略微检测到,但VEGFR2普遍分布在内皮细胞中。同时Li等[30]通过Apelin/APJ敲除小鼠研究Apelin在糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema,DME)中的作用,检测到Apelin诱导人视网膜微血管内皮细胞(human retinal microvascular endothelial cell,HRMECs)的增殖和迁移,促进正常和高糖条件下细胞骨架蛋白质磷酸化和紧密连接。他们还发现Apelin在体外和体内均激活了PI-3K /AKT和MEK/ERK信号通路。 最重要的是Apelin/APJ系统参与DR的病理学,并且发现Apelin-13是通过PI-3K/AKT和MAPK/ERK信号通路在DME中作为细胞骨架和紧密连接的早期启动子。这些结果表明APJ拮抗剂比VEGFR2抑制剂更有选择性地抑制缺血性视网膜病变中的病理性视网膜血管生成。这些工作坚定地建立了APJ作为治疗眼部新生血管形成的新型、可化学处理的治疗靶标,同时为抗VEGF药物治疗无效的患者提供了多元化选择。
3 配体组学技术在抗视网膜新生血管中的应用
配体组学技术最初设计用于全局鉴定细胞范围的配体来发现致病或治疗配体[34-36],并且研究发现配体组学技术可以通过不同的配体富集策略(包括结合和功能选择)发现广泛适用于体外或体内环境中的任何类型的细胞或疾病的配体[37-38]。目前,配体组学技术在抗视网膜新生血管方面也取得了一定成效,Wang等[39]和Leblanc等[40]将比较配体组学进行了高通量筛选应用于糖尿病小鼠和对照小鼠,用于疾病相关内皮配体的差异作图。DR-high Scg3充分证明了比较配体组学的主要优点:常规配体筛选方法可能忽略了对健康细胞具有相对低结合活性的疾病高配体。分泌颗粒素(Secretogranin Ⅲ,Scg3)属于granin家族,其由嗜铬粒蛋白A(chromogranin A,CgA)、CgB和Scg2-7组成。Scg3是CgA的结合配偶体,在合成分泌颗粒和分泌肽激素中起着重要的作用。据报道,Scg3由功能失调的β细胞分泌,因此在1型糖尿病中可能会发现Scg3的上调。
Scg3被发现是一种新的疾病相关配体,在患糖尿病时仅在不健康的血管中具有选择性结合和血管生成活性。相反,VEGF在糖尿病和正常脉管系统中结合并诱导血管生成。Scg3和VEGF通过不同的受体途径发出信号。重要的是,Scg3中和抗体可以高效地减轻糖尿病小鼠的视网膜血管渗漏。此外,抗Scg3阻止氧诱导的视网膜病变小鼠中的视网膜新血管形成,这是早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,ROP)的替代模型。Leblanc等[40]发现抗Scg3治疗对OIR有很高的疗效。Scg3的高疾病选择性暗示抗Scg3疗法可能对正常血管具有最小的不良反应。并且发现Scg3通过激活ERK[41]和Src途径,但不激活蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)和信号转导与活化转录因子(signal transducers and activators of transcription,Stat3)以调节血管生成和血管渗漏。ROP是儿童视力损害的最常见原因[42],目前临床上还没有批准的药物用于治疗。这些结果表明Scg3是DR和ROP的新型抗血管生成治疗的有希望的靶标。
4 小结
生物靶向抑制剂在眼底新生血管治疗中发挥越来越重要的作用,为了预防和抑制眼底新生血管,一些与新生血管相关的因子如抗新生血管抗体、受体调节剂及新生血管通路抑制剂均被用于临床。这些新型治疗方法在临床实践中的疗效及安全性还需进一步研究证实。总之,生物靶向抑制剂为眼底新生血管的治疗带来了新曙光,值得进一步研究。
[1] TALKS J S,LOTERY A J,HANCHI F,SIVAPRASAD S,JOHNSTON R L,PATEL N,et al.First-year visual acuity outcomes of providing aflibercept according to the VIEW study protocol for age-related macular degeneration[J].Ophthalmology,2016,123(2):337-343.
[2] MAGUIRE M G,MARTIN D F,YING G S,JAFFE G J,DANIEL E,GRUNWALD J E,et al.Five-year outcomes with anti-vascular endothelial growth factor treatment of neovascular age-related macular degeneration:The comparison of age-related macular degeneration treatments trials[J].Ophthalmology,2016,123(8):1751-1761.
[3] SIMONS M,GORDON E,CLAESSON-WELSH L.Mechanisms and regulation of endothelial VEGF receptor signalling[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2016,17(10):611-625.
[4] CLAESSON-WELSH L.VEGF receptor signal transduction - a brief update[J].Vascul Pharmacol,2016,86:14-17.
[5] EVANS I.An overview of VEGF-mediated signal transduction[J].Methods Mol Biol,2015,1332:91-120.
[6] KOCH S,TUGUES S,LI X,GUALANDI L,CLAESSON-WELSH L.Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors[J].Biochem J,2011,437(2):169-183.
[7] FERRARA N,GERBER H P,LECOUTER J.The biology of VEGF and its receptors[J].Nat Med,2003,9(6):669-676.
[8] GERHARDT H,GOLDING M,FRUTTIGER M,RUHRBERG C,LUNDKVIST A,ABRAMSSON A,et al.VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia[J].J Cell Biol,2003,161:1163-1177.
[9] PARK S W,KIM J H,KIM K E,JEONG M H,PARK H,PARK B,et al.Beta-lapachone inhibits pathological retinal neovascularization in oxygen-induced retinopathy via regulation of HIF-1alpha[J].J Cell Mol Med,2014,18(5):875-884.
[10] PAKZAD-VAEZI K,ALBIANI D A,KIRKER A W,MERKUR A B,KERTES P J,ENG K T,et al.A randomized study comparing the efficacy of bevacizumab and ranibizumab as pre-treatment for pars plana vitrectomy in proliferative diabetic retinopathy[J].Ophthalmol Surg Las Imag Ret,2014,45(6):521-524.
[11] HU J,HOANG Q V,CHAU F Y,BLAIR M P,LIM J I.Intravitreal anti-vascular endothelial growth factor for choroidal neovascularization in ocular histoplasmosis[J].Retin Cases Brief Rep,2014,8(1):24-29.
[12] SCHMUCKER C,EHLKEN C,HANSEN L L,ANTES G,AGOSTINI H T,LELGEMANN M.Intravitreal bevacizumab (Avastin) vs.ranibizumab (Lucentis) for the treatment of age-related macular degeneration:a systematic review[J].Curr Opin Ophthalmol,2010,21(3):218-226.
[13] YANCOPOULOS G D,DAVIS S,GALE N W,RUDGE J S,WIEGAND S J,HOLASH J.Vascular-specific growth factors and blood vessel formation[J].Nature,2000,407(6801):242-248.
[14] OHR M,KAISER P K.Intravitreal aflibercept injection for neovascular (wet) age-related macular degeneration[J].Expert Opin Pharmacother,2012,13(4):585-591.
[15] ALESSI D R,JAMES S R,DOWNES C P,HOLMES A B,GAFFNEY PR,REESE C B,et al.Characterization of a 3-phosphoinositide-dependent protein kinase which phosphorylates and activates protein kinase Balpha[J].Curr Biol,1997,7(4):261-269.
[16] SUN J,HUANG W,YANG S F,ZHANG X P,YU Q,ZHANG Z Q,et al.Galphai1 and Galphai3 mediate VEGF-induced VEGFR2 endocytosis,signaling and angiogenesis[J].Theranostics,2018,8(17):4695-4709.
[17] TAE N,LEE S,KIM O,PARK J,NA S,LEE J H.Syntenin promotes VEGF-induced VEGFR2 endocytosis and angiogenesis by increasing ephrin-B2 function in endothelial cells[J].Oncotarget,2017,8(24):38886-38901.
[18] SAWAMIPHAK S,SEIDEL S,ESSMANN C L,WILKINSON G A,PITULESCU M E,ACKER T,et al.Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis[J].Nature,2010,465(7297):487-491.
[19] ELICEIRI B P,PAUL R,SCHWARTZBERG P L,HOOD J D,LENG J,CHERESH D A.Selective requirement for Src kinases during VEGF-induced angiogenesis and vascular permeability[J].Mol Cell,1999,4(6):915-924.
[20] TOUTOUNCHIAN J J,PAGADALA J,MILLER D D,BAUDRY J,PARK F,CHAUM E,et al.Novel small molecule JP-153 targets the Src-FAK-Paxillin signaling complex to inhibit vegf-induced retinal angiogenesis[J].Mol Pharmacol,2017,91(1):1-13.
[21] HE Y X,LIU J,GUO B,WANG Y X,PAN X,LI D,et al.Src inhibitor reduces permeability without disturbing vascularization and prevents bone destruction in steroid-associated osteonecrotic lesions in rabbits[J].sci Rep,2015,5(9):8856.
[22] ZHANG Q,WANG D,KUNDUMANI-SRIDHARAN V,GADIPARTHI L,JOHNSON D A,TIGYI G J,et al.PLD1-dependent PKCgamma activation downstream to Src is essential for the development of pathologic retinal neovascularization[J].Blood,2010,116(8):1377-1385.
[23] SEO S,SUH W.Antiangiogenic effect of dasatinib in murine models of oxygen-induced retinopathy and laser-induced choroidal neovascularization[J].Mol Vis,2017,23:823-831.
[24] DUKIC-STEFANOVIC S,WALTHER J,WOSCH S,ZIMMERMANN G,WIEDEMANN P,ALEXANDER H,et al.Chorionic gonadotropin and its receptor are both expressed in human retina,possible implications in normal and pathological conditions[J].PLoS ONE,2012,7(12):e52567.
[25] MOVSAS T Z,MUTHUSAMY A.The potential effect of human chorionic gonadotropin on vasoproliferative disorders of the immature retina[J].Neuroreport,2018,29(18):1525-1529.
[26] FAN X,ZHOU N,ZHANG X,MUKHTAR M,LU Z,FANG J,et al.Structural and functional study of the apelin-13 peptide,an endogenous ligand of the HIV-1 coreceptor,APJ[J].Biochemistry-US,2003,42(34):10163-10168.
[27] COX C M,D’AGOSTINO S L,MILLER M K,HEIMARK R L,KRIEG P A.Apelin,the ligand for the endothelial G-protein-coupled receptor,APJ,is a potent angiogenic factor required for normal vascular development of the frog embryo[J].Dev Biol,2006,296:177-189.
[28] KASAI A,SHINTANI N,ODA M,KAKUDA M,HASHIMOTO H,MATSUDA T,et al.Apelin is a novel angiogenic factor in retinal endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,325(2):395-400.
[29] MUTO J,SHIRABE K,YOSHIZUMI T,IKEGAMI T,AISHIMA S,ISHIGAMI K,et al.The apelin-APJ system induces tumor arteriogenesis in hepatocellular carcinoma[J].Anticancer Res,2014,34(10):5313-5320.
[30] LI Y,BAI Y,JIANG Y,YU W,SHI X,CHEN L,et al.Apelin-13 is an early promoter of cytoskeleton and tight junction in diabetic macular edema via PI-3K/Akt and MAPK/Erk signaling pathways[J].BioMed Res Int,2018,17:1-18.
[31] KASAI A,SHINTANI N,KATO H,MATSUDA S,GOMI F,HABA R,et al.Retardation of retinal vascular development in apelin-deficient mice[J].Arter Thromb Vasc Biol,2008,28(10):1717-1722.
[32] MCANALLY D,SIDDIQUEE K,GOMAA A,SZABO A,VASILE S,MALONEY P R,et al.Repurposing antimalarial aminoquinolines and related compounds for treatment of retinal neovascularization[J].PLoS ONE,2018,13(9):e202436.
[33] ISHIMARU Y,SHIBAGAKI F,YAMAMURO A,YOSHIOKA Y,MAEDA S.An apelin receptor antagonist prevents pathological retinal angiogenesis with ischemic retinopathy in mice[J].Sci Rep,2017,7(1):15062.
[34] KOWALEWSKI D J,STEVANOVIC S,RAMMENSEE H G,STICKEL J S.Antileukemia T-cell responses in CLL-We don’t need no aberration[J].Oncoimmunology,2015,4(7):e1011527.
[35] WALZ S,STICKEL J S,KOWALEWSKI D J,SCHUSTER H,WEISEL K,BACKERT L,et al.The antigenic landscape of multiple myeloma:mass spectrometry (re)defines targets for T-cell–based immunotherapy[J].Blood,2015,126(10):1203-1213.
[36] LEBLANC M E,WANG W,CABEROY N B,CHEN X,GUO F,ALVARADO G,et al.Hepatoma-derived growth factor-related protein-3 is a novel angiogenic factor[J].PLoS ONE,2015,10(5):e0127904.
[37] DING Y,CABEROY N B,GUO F,LEBLANC M E,ZHANG C,WANG W,et al.Reticulocalbin-1 facilitates microglial phagocytosis[J].PLoS ONE,2015,10(5):e126993.
[38] GUO F,DING Y,CABEROY N,ALVARADO G,WANG F,CHEN R,et al.ABCF1 extrinsically regulates retinal pigment epithelial cell phagocytosis[J].Mol Biol Cell,2015,26(12):2311-2320.
[39] WANG W,LEBLANC M E,CHEN X,CHEN P,JI Y,BREWER M,et al.Pathogenic role and therapeutic potential of pleiotrophin in mouse models of ocular vascular disease[J].Angiogenesis,2017,20(4):479-492.
[40] LEBLANC M E,WANG W,CHEN X,CABEROY N B,GUO F,SHEN C,et al.Secretogranin III as a disease-associated ligand for antiangiogenic therapy of diabetic retinopathy[J].J Exp Med,2017,214(4):1029-1047.
[41] WITTICH W,LORENZINI M C,MARKOWITZ S N,TOLENTINO M,GARTNER S A,GOLDSTEIN J E,et al.The effect of a head-mounted low vision device on visual function[J].Optom Vis Sci,2018,95(9):774-784.
[42] WANG Y,ZHOU X G,CHEN Z J.Advances in treatment of retinopathy of prematurity[J].Chin J Appl Clin Pediatr,2017,32(2):146-148.