摘 要：目的:探究自身免疫性溶血性贫血(AIHA)患者免疫细胞与免疫球蛋白检测的临床意义。方法:选取2014年6月—2019年10月收治的60例AIHA患者为观察组，另选取30例同期健康体检人群作为对照组。采用红细胞放散液进行免疫球蛋白IgG亚类检测，结合患者血细胞参数[白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)],比较2组患者IgG亚类含量及血细胞参数，经受试者工作曲线(ROC)评估各IgG亚类含量对AIHA的诊断价值，并采用Pearson相关分析AIHA患者免疫球蛋白与血细胞参数的关系。依据临床疗效标准将观察组患者分为缓解组及非缓解组，流式细胞仪检测2组外周血免疫细胞T细胞比例水平，采用Spearman相关分析AIHA患者免疫细胞与治疗疗效的关系。结果:观察组IgG1、IgG2、IgG3、IgG4含量、WBC水平明显高于对照组(P<0.05);RBC、HGB、HCT水平明显低于对照组(P<0.05);ROC曲线显示，单独检测IgG1、IgG3及联合检测IgG1、IgG2、IgG3和IgG4含量均可作为AIHA患者临床诊断的效能指标(P均<0.05);经Pearson相关分析，AIHA患者WBC水平与IgG1、IgG2含量呈反比(P<0.05),RBC、HGB、HCT水平与IgG1含量均呈正比(P<0.05);缓解组CD3+CD69+/CD3+比例、CD3+CD4+CD69+/CD3+CD4+比例明显高于非缓解组(P<0.05);经Spearman相关分析，AIHA患者CD3+CD69+/CD3+比例、CD3+CD4+CD69+/CD3+CD4+比例与临床疗效均具有正相关性(均P<0.05)。结论:AIHA患者外周血CD4+CD69+T细胞增高，且发病与IgG1、IgG3有关，尽早检测对其诊断及治疗均有重要意义。
关键词：自身免疫性溶血性贫血 免疫细胞 免疫球蛋白 临床意义 血细胞参数
Clinical significance of detection of immune cells and immunoglobulins in patients with autoimmune hemolytic anemia
LIU Bo ZHANG Wenling WANG Meng JIN Liang WANG Weiwei LIN Cui YANG Bo YU Danjun
Department of Blood Transfusion, the First Hospital of Qinhuangdao; Department of Laboratory Medicine, Chinese PLA General Hospital;
Abstract：Objective: To explore the clinical significance of detection of immune cells and immunoglobulins in patients with autoimmune hemolytic anemia(AIHA). Methods: A total of 60 patients with AIHA admitted to the hospital from June 2014 to October 2019 were selected as observation group, and 30 healthy people for physical examination during the same time period were set as control group. Red blood cell dispersion was used to detect immunoglobulin IgG subclasses and combined with the blood cell parameters(white blood cell[WBC], red blood cell[RBC], hemoglobin[HGB], hematocrit[HCT]), and the levels of IgG subclasses and blood cell parameters were compared between the two groups. Receiver operating characteristic(ROC) curve was used to evaluate the diagnostic value of each IgG subclass on AIHA, and Pearson correlation analysis was used to analyze the relationship between immunoglobulins and blood cell parameters in patients with AIHA. According to clinical efficacy criteria, the patients in observation group were divided into remission group and non-remission group. Flow cytometry was used to detect the proportions of peripheral blood immune cells and T cells in the two groups, and Spearman correlation analysis was applied to analyze the relationship between immune cells and treatment efficacy in patients with AIHA. Results: The levels of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 and WBC in observation group were significantly higher than those in control group(P<0.05). The levels of RBC, HGB and HCT were significantly lower than those in control group(P<0.05). ROC curve showed that single detection of IgG1 and IgG3 and the combined detection of IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 could be used as efficacy indicators for clinical diagnosis of patients with AIHA(all P<0.05). Pearson correlation analysis showed that WBC level in patients with AIHA was inversely proportional to IgG1 and IgG2(P<0.05), and levels of RBC, HGB and HCT were proportional to IgG1(P<0.05). The proportion of CD3+CD69+/CD3+and proportion of CD3+CD4+CD69+/CD3+CD4+in remission group were significantly higher than those in non-remission group(P<0.05). According to Spearman correlation analysis, the proportion of CD3+CD69+/CD3+and proportion of CD3+CD4+CD69+/CD3+CD4+in patients with AIHA were positively correlated with clinical efficacy(all P<0.05). Conclusion: The CD4+CD69+T cells were increased in peripheral blood of patients with AIHA, and the disease onset was associated with IgG1 and IgG3. Early detection might be of great significance for its diagnosis and treatment.
Keyword：autoimmune hemolytic anemia; immune cells; immunoglobulins; clinical significance; blood cell parameters;
自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia, AIHA)是一类因自身免疫功能紊乱而导致抗体及补体异常吸附至红细胞表面，并引起溶血性贫血症状的血液系统疾病[1]。患者主要表现为贫血、黄疸、肝脾肿大等，若不及时治疗可并发出血及感染，增加临床治疗困难度[2]。研究发现，AIHA患者免疫功能紊乱，并导致自身抗体黏附与红细胞表面，引起血细胞参数变化，而该病发生发展与患者体内CD4+效应T细胞分化及免疫球蛋白亚型密切相关[3]。部分报道已证实AIHA患者存在外周血CD4+、CD8+等免疫细胞表达异常[4]。CD69为C-型凝集素受体的一种，可增强免疫细胞活性，但与AIHA发病是否相关尚无定论[5]。另外，临床根据病因将AIHA分为继发性与原发性，根据抗体特点又可分为温抗体型、冷抗体型及混合型，其中温抗体型再细分为免疫复合型(IgG+C3 d)与单纯型(IgG/C3 d),表明免疫球蛋白亚型的不同可能参与AIHA发病[6]。基于此，本研究旨在探究AIHA患者免疫细胞与免疫球蛋白检测的临床意义。
1 资料与方法
1.1 对象
选取2014年6月—2019年10月我院收治的63例AIHA患者为观察组，其中3例患者研究过程中因流动等原因造成失访，最终确定观察组患者60例，其中男37例，女23例；年龄25～56岁，平均(40.46±6.18)岁；体质指数(BMI)22～27 kg/m2,平均(24.59±1.23) kg/m2;继发性21例，原发性39例；温抗体型51例，冷抗体型9例。纳入标准：①符合《血液病诊断及疗效标准》第3版[7]中AIHA诊断标准者；②临床各项检查资料完整者；③自愿签署知情同意书者；④年龄≥18岁；⑤因贫血、黄疸、胸闷等症状入院治疗者。排除标准：①具有糖皮质激素、免疫抑制剂等药物治疗或支持性治疗史者；②妊娠期妇女；③因遗传、物理化学、药物因素导致的溶血者；④合并白血病、血友病、过敏性紫癜等造血系统疾病者；⑤合并恶性肿瘤者。选取30例同期健康体检人群作为对照组(均排除贫血性疾病),男16例，女14例；年龄24～60岁，平均(41.03±6.49)岁；BMI 21～27 kg/m2,平均(24.06±1.46) kg/m2。2组患者性别、年龄、BMI比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
1.2 指标检测方法
清晨抽取患者肘静脉血2 mL,于350×g,20 min离心分离出血清，贮于-70℃低温冰箱内保存。使用Ficoll淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，50 μL标本分别加入两PR管中，其中试验管中预先加入CD3-APC、CD4-FITC、CD8-Percp、CD69-PE各20 μL,对照管各自加入IgG1-APC、IgG1-FITC、IgG1-Percp、IgG1-PE,常温孵育30 min, FACSVerse流式细胞仪中CellQuest软件分析，以荧光抗体染色阳性的细胞百分数记为CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD69+、CD3+CD4+CD69+、CD3+CD8+CD69+T细胞比例水平。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法检测血浆IgG1、IgG2、IgG3和IgG4水平，严格依据试剂盒指示进行检测。采用库贝尔全自动血液细胞分析仪MC-600(深圳市奥特库贝科技有限公司)测定白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)水平。
1.3 观察指标
比较2组IgG亚类含量及血细胞参数，经受试者工作曲线(ROC)评估各IgG亚类含量对AIHA的诊断价值，并采用Pearson相关分析AIHA患者免疫球蛋白与血细胞参数的关系。依据临床疗效标准将观察组患者分为缓解组及非缓解组，流式细胞仪检测2组外周血免疫细胞(CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD69+、CD3+CD4+CD69+、CD3+CD8+CD69+)T细胞比例水平，采用Spearman相关分析AIHA患者免疫细胞与治疗疗效的关系。
1.4 统计学方法
采用spss 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料以x¯±s表示，组间比较采用t检验，对统计学有意义的结果进一步采用SNK-q检验；AIHA患者免疫球蛋白与血细胞参数的关系采用Pearson相关分析，AIHA患者免疫细胞与治疗疗效的关系采用Spearman相关检验分析，对预测因子进行ROC曲线分析，分析各IgG亚类含量对AIHA的诊断价值，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 观察组及对照组IgG亚类含量水平比较
观察组IgG1、IgG2、IgG3和IgG4含量水平明显高于对照组(P<0.05),见表1。
2.2 观察组及对照组血细胞参数水平比较
观察组RBC、HGB、HCT水平明显低于对照组(P<0.05),而WBC水平明显高于对照组(P<0.05),见表2。
2.3 各IgG亚类含量对AIHA的诊断价值
ROC曲线显示，单独检测IgG1、IgG3及联合检测IgG1、IgG2、IgG3和IgG4含量均可作为AIHA患者临床诊断的效能指标(均P<0.05),见表3、图1。
表1 观察组及对照组IgG1、IgG2、IgG3和IgG4含量水平比较g/L,x¯±s
表2 观察组及对照组WBC、RBC、HGB、HCT水平比较x¯±s
表3 IgG1、IgG2、IgG3和IgG4含量水平对AIHA的诊断价值
图1 IgG1、IgG2、IgG3和IgG4含量水平对AIHA诊断的ROC曲线图
2.4 AIHA患者免疫球蛋白与血细胞参数间相关性
经Pearson相关分析，AIHA患者WBC水平与IgG1、IgG2含量呈反比(P<0.05),RBC水平与IgG1含量呈正比(P<0.05),HGB水平与IgG1含量呈正比(P<0.05),HCT水平与IgG1含量呈正比(P<0.05),见表4。
2.5 缓解组及非缓解组外周血免疫细胞比较
缓解组CD3+CD69+/CD3+比例、CD3+CD4+CD69+/CD3+CD4+比例明显高于非缓解组(P<0.05),2组CD3+CD8+CD69+/CD3+CD8+比例比较，差异无统计学意义(P>0.05),见表5。
2.6 相关性分析
经Spearman相关分析，AIHA患者CD3+CD69+/CD3+比例、CD3+CD4+CD69+/CD3+CD4+比例与临床疗效均呈正相关性(均P<0.05),见表6。
表4 AIHA患者免疫球蛋白与血细胞参数间相关性
表5 缓解组及非缓解组外周血免疫细胞比例比较x¯±s
表6 AIHA患者免疫细胞与治疗疗效的相关性分析
3 讨论
AIHA是一类因自身免疫系统紊乱而导致抗红细胞自身抗体异常出现，引起溶血性贫血的自身免疫性疾病[8]。T淋巴细胞及B淋巴细胞在正常生理条件下共同影响维持人体免疫功能，同样与自身免疫性疾病的发生发展具有密切关联，因此，检测AIHA患者免疫细胞与免疫球蛋白水平，对临床了解AIHA发病机制有重要意义。
AIHA临床以温抗体型为主，而部分研究报道显示，AIHA患者疾病预后与免疫球蛋白亚型有关，其中IgG是血清中含量最高的一种，可高达70%～75%,根据抗原性差异及二硫键数目等的不同又可细分为IgG1、IgG2、IgG3及IgG4,含量依次减少，每种免疫球蛋白均具有各自不同特性[9]。IgG1可激活补体，并与吞噬细胞特异性结合，IgG2可中和抗原或阻滞受体配体结合，IgG3对蛋白酶切割不稳定，可诱发抗体依赖的细胞毒性及抗体依赖的细胞吞噬，但半衰期较短，IgG4最不活跃，主要参与过敏反应[10]。本研究结果显示，观察组IgG1、IgG2、IgG3、IgG4含量、WBC水平明显高于对照组，RBC、HGB、HCT水平明显低于对照组，提示AIHA发病后IgG1、IgG2、IgG3及IgG4均可表达，且参与溶血。而ROC曲线显示，单独检测IgG1、IgG3及联合检测IgG1、IgG2、IgG3和IgG4含量均可作为AIHA患者临床诊断的效能指标，分析原因，是AIHA发病急性期红细胞结合的免疫球蛋白中IgG1、IgG3是导致其贫血的主要原因，而与血细胞参数间的相关性则是因为AIHA患者病情越严重，其溶血程度越厉害，血浆内IgG1被消耗越多，使得机体失代偿，而4种亚型的溶血能力为IgG1>IgG2>IgG3>IgG4,其中IgG3又最容易与红细胞结合。
既往诸多研究表明，有关自身免疫系统疾病患者体内T细胞活化，多表现为CD4+/CD8+紊乱。其中CD4+T细胞具有理想的免疫调节功能，可辅助T淋巴细胞及B淋巴细胞转化为效应细胞或抗体分泌细胞，而传统意义上多认为自身免疫系统疾病与CD4+T细胞具有显著联系。近年来，越来越多的新分子被发现，其中分化抗原簇的CD69分子是T细胞接受刺激信号以后最早合成分泌的一个分子，已证实不被静止的T细胞表达，因此，早期检测CD4+CD69+T细胞可在一定程度上显示T细胞功能状态。李腾达等[11]研究发现，CD69+CD4+CD25-T细胞可能参与自身免疫性胰腺炎的免疫病理过程，在患者外周血中表达异常升高，并与白细胞介素-4、γ干扰素等因子呈显著负相关。而本研究结果显示，AIHA治疗后得到缓解的患者CD3+CD69+/CD3+比例、CD3+CD4+CD69+/CD3+CD4+比例明显高于非缓解组，且与临床疗效均具有正相关性。与研究结果中AIHA/Evans综合征溶血发作患者外周血CD69+T细胞比例较缓解患者增高具有相似之处。以上结果的出现证实外周血CD69+T细胞参与了AIHA的发病，分析原因，是因为T淋巴细胞根据功能分类中辅助性T细胞及调节性T细胞均参与AIHA的发生发展，而CD69+T细胞为免疫抑制细胞，早期活化诱导分子，可参与免疫调节，当T细胞活化1 h后立即表达，并随后表达量达到高峰值，可持续72 h。本研究不足之处在于免疫球蛋白及免疫细胞水平的测量方法有限，可能存在更精确、更可靠等方案，对结果是否存在影响尚不得知，待后续改善后再次探讨。
综上所述，AIHA患者外周血中CD69+T细胞比例及IgG1、IgG3含量异常升高，可作为临床诊断的重要依据，以寻找可能的生物治疗靶点。
[1] Woolley AE,Montgomery MW,Savage WJ,et al.Post-Babesiosis Warm Autoimmune Hemolytic Anemia[J].N Engl J Med,2017,376(10):939-946.
[2] Okawa S,Kayatani H,Fujiwara K,et al.Pembrolizumab-induced Autoimmune Hemolytic Anemia and Hemophagocytic Lymphohistiocytosis in Non-small Cell Lung Cancer[J].Intern Med,2019,58(5):699-702
[3] Ichikawa S,Sasaoka A,Fukuhara N,et al.Primary ovarian diffuse large B-cell lymphoma preceded by autoimmune hemolytic anemia[J].J Hematopathol,2020,13(1):63-67.
[4] 陈芳，孙素真，杜雅坤，等.自身免疫性脑炎患儿及肺炎支原体脑炎患儿外周血淋巴细胞免疫、体液免疫表达水平及意义[J].中国医师进修杂志，2020,43(10):922-926.
[5] 张珊，宋新龙，王爱迪，等.CD4～+T细胞的分化调节及其在再生障碍性贫血中作用的研究进展[J].天津医药，2018,46(10):1123-1126.
[6] 邢莉民，邵宗鸿.自身免疫性溶血性贫血/Evans综合征患者不同B细胞亚群活化通路存在差异[J].中华内科杂志，2019,(11):841.
[7] 张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].3版.北京：科学出版社，2007:68-71.
[8] Enzo,Fagiolo.Study of Five Cases of Autoimmune Hemolytic Anemia in the Course of Hemoblastosis.:[J].Tumori Journal,2018,60(4):337-343.
[9] 张秋会，胡兴斌，安群星，等.多种红细胞抗原相合性输血在自身免疫性溶血性贫血患者中的临床应用[J].临床血液学杂志，2020,33(2):87-89.
[10] Ahmad I,Majeed Memon A,Moiz B.Mixed IgM cold and IgG warm autoimmune hemolytic anemia complicated by acral gangrene[J].Transfusion,2018,58(5):1093-1094.
[11] 李腾达，龙曙萍，黄元兰，等.CD69+CD4+CD25-T在自身免疫性胰腺炎患者外周血中表达升高及临床意义[J].现代检验医学杂志，2017,32(4):29-31.