陈威丞1 芮蕾2 温汉春2 朱继金2
1.广西医科大学第一附属医院心血管研究所，广西南宁530021；
2.广西医科大学第一附属医院急诊科，广西南宁530021
基金项目：国家临床重点专科建设项目（卫办医政函［2012］649号）。
【摘要】目的：探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对人源性心脏微血管内皮细胞（HCMECs）的影响。方法：在正常培养条件下，将100nmol/LAngⅡ加入细胞中，与HCMECs共孵育12h，用蛋白印迹法检测和细胞酶联免疫法分别检测神经调节蛋白1（NRG-1）的蛋白表达和神经调节蛋白1亚集（NRG-1β）分泌情况。结果：与空白组比较，AngⅡ处理组的NRG-1的蛋白表达和NRG-1β的分泌降低（P＜0.05）。结论：AngⅡ能减少HCMECs的NRG-1的表达和NRG-1β分泌。
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关键词 人源性心脏微血管内皮细胞；神经调节蛋白-1；血管紧张素Ⅱ；表达影响
【中图分类号】R541.6【文献标志码】A【文章编号】1007-8517(2015)03-0018-03
NRG-1是表皮生长因子家族的成员之一，是一个穿膜多肽生长因子的子集，属于表皮生长因子家族，表达于神经系统、心血管系统、乳腺、肠和肾脏。NRG-1通过酪氨酸激酶受体(ErbB2、ErbB3和ErbB4)介导其生物学效应，ErbB2虽然不与NRG-1直接结合，但可与ErbB3和ErbB4结合后形成异源二聚体，NRG-1可通过反式磷酸化过程引起ErbB2形成异源二聚体发生磷酸化，从而促进下游信号通路传导，激活其下游信号通路促丝裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）途径。微血管内皮细胞是位于循环血液与组织液之间的单层上皮细胞，构成血管通透性的物理屏障，保证血管内外的物质交换。NRG-1在血管生成和心力衰竭中起着不可缺少的作用。近期研究表明［1］，聚乳酸聚乙醇酸共聚物微粒装载NRG-1和酸性纤维母细胞生长因子可以用来改善急性心肌梗死后的心脏功能，是通过增加血管生成，抑制心肌重构。
1材料和方法
1.1仪器与试剂人源性心脏微血管内皮细胞株（编号6000），胎牛血清25ml（编号8248），双抗（编号0106），纤维连接蛋白原液（编号0103），内皮细胞生长添加剂(编号0113)，胰酶（编号0113）（上述试剂全购自美国sciencell公司），DMEM低糖培养基（编号31600-034，购自Gibco公司），NRG-1抗体（编号MAB3771，购自美国RD公司），内参抗体GAPDH（编号FL-335：ZS25778，购自中国中杉金桥公司），人源性NRG-1β酶联免疫吸附测定法试剂盒（编号119-14819，购自美国RayBiotech公司），超低温冰箱（DW-86L388型中国海尔公司），5%CO2培养箱（编号3110，购买于美国ThermoElectron公司）。
1.2HCMECs培养细胞复苏前准备一瓶含有纤维膜的培养瓶（复苏前2h在空培养瓶25cm，加入4ml无血清的培养基，然后加入25μl纤维连接蛋白原液，放入37℃培养箱培养，培养2h以后取出液体，造纤维膜成功）取人源性心脏微血管内皮细胞株常规复苏后，本研究室常规传代培养，每瓶培养瓶都用25μl纤维连接蛋白原液，造出纤维膜，37°C、5%CO2培养。当细胞生长成单层达80%到90%的培养面积，用0.25%胰酶消化，传代，用5、6代HCMECs用于实验。
1.3蛋白免疫印迹检测NRG-1蛋白表达收集各组细胞分别装入到小EP管中，加入裂解液和PMSF提取细胞总蛋白，Bradford法测定蛋白的浓度，取蛋白样品10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，待电泳完毕，NRG-1用100mA的电流转膜，内参转60min，NRG-1转90min，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，在室温下用脱脂奶粉封闭后，分别加入鼠抗人多克隆抗体NRG-1（1∶500），4°C孵育过夜，漂洗后加二抗（1∶5000），37℃孵育1h，漂洗后去暗室X光胶片曝光，加入ECL发光剂，暗房显影，用QuantityOne软件分析目标条带的灰度值，以目标条带灰度值与内参条带灰度值的比值作为目的基因蛋白的相对表达量。
1.4酶联免疫吸附测定法检测NRG-1β蛋白的分泌收集各组细胞培养液分别装入到3KD的millipore蛋白离心管中，在角度转子离心机中温度调定为4°C，用5000离心力离心1h，剩余大概250μl左右，放入-80℃冰箱备用。使用前将所有的试剂和样品放在室温中0.5h，将准备好的100μl标准品和样品分别加入到相应的孔中，盖好以后，在室温中轻轻摇动孵育2.5h，弃去溶液，用已经准备好的300μl洗涤液洗4次，最后一次洗涤要把洗涤液完全移去，然后加入100μl制备好生物素标记抗体到每个孔中，在室温中轻轻摇动孵育1h，弃去溶液，用每次300μl洗涤液洗4次，弃去溶液并加入制备好的HRP溶液到每个孔中，在室温中轻轻摇动孵育45min，弃去溶液，每次用300μl洗涤液洗4次，然后加入100μlTMB到每个孔中，避光轻轻摇动在室温里孵育30min，加入50μl终止液到每孔，在450nm读数。
1.5统计学处理采用spss16.0统计软件进行统计学分析。主要试验数据来自3次以上重复试验，以均数±标准差(x±s)表示，对主要指标进行正态性分布检验，符合正态分布的多组间样本比较采用单因素ANOVA检验，用LSD方法进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1光镜下细胞形态观察倒置显微镜下观察HCMECs生长成一个融合单层，细胞的形态呈菱形和多边形。如图1。
3讨论
本研究发现，AngⅡ明显减少HCMECs的NRG-1表达和NRG-1β分泌。
在成人心脏中，NRG-1主要由内皮细胞和微血管内皮细胞表达和释放，而在大的冠状动脉、静脉及主动脉却不表达。内皮功能不全的一个重要的特征是一氧化氮/内皮素水平导致的内皮收缩舒张血管功能异常。在各种病理因素的作用下，内皮细胞可以分泌多种内源性活性物质促进动脉粥样硬化斑块和血栓的形成。有研究证实，冠状动脉内皮功能失调与脂质斑块形成有关［2］。有大量的实验研究表明，心内膜和冠状微血管中的心脏血管内皮细胞直接影响心脏的机械性能、生长和相邻的心肌的节律。这些影响可能是由扩散物质引起的（如氧化氮，前列腺素和内皮素-1），然而近期研究表明是NRG-1介导这些调节的［3］。内皮细胞和心肌细胞之间的非旁分泌相互作用，涉及血管内皮依赖性的电化学梯度［4］。内皮细胞的活化和随后的功能障碍发生相应于生理和病理生理的刺激，并且在心血管稳态和疾病的早期［3］。NRG1-ErbB信号在心脏的发育及维持人类成年心脏结构和功能的完整性中有不可或缺的作用，现在一些动物研究已经证明［5］，在急性心肌损伤和慢性心力衰竭期间重组NRG1的治疗效果，它能改善动物的心功能，提高动物的存活率。在高糖的状态下和诱导糖尿病的大鼠模型中已证实可以降低NRG-1的表达，这项发现支持我们的研究结果，AngⅡ能明显降低HCMECs的NRG-1表达和NRG-1β分泌，心力衰竭的患者由于RAAS的过度激活，体内AngⅡ持续处于高水平状态，AngⅡ可抑制HCMECs表达NRG-1，导致机体NRG-1持续处于低水平状态导致心肌细胞凋亡，加大心肌细胞数量的减少；可促使机体发生病理反应，造成心脏的损伤；并可促进平滑肌增生，也导致血管狭窄。我们的研究证实了当AngⅡ增高的时候，AngⅡ能明显降低HCMECs的NRG-1表达和NRG-1β分泌，影响心脏的功能。临床上慢性心力衰竭的患者给予血管紧张素受体拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂类及β受体阻滞剂能明显改善生存率，这或许与促进NRG-1的表达有关。
本研究证实，AngⅡ能降低HCMECs的NRG-1表达和NRG-1β分泌，推测可在心力衰竭的病人中通过增加NRG-1来提高心脏的功能，但这需要大量的临床试验来进一步证实。
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参考文献
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(收稿日期：2014.11.08)