周本宏1,2 易慧兰1 王耀华1 张婵2 凃杰2
1 武汉大学人民医院，湖北武汉430060；2 武汉大学药学院，湖北武汉430072
【摘要】目的：优选地榆中鞣质最佳提取工艺。方法：以提取物中总鞣质含量为指标，通过单因素试验研究提取溶剂、料液比、超声提取时间、超声提取次数等四个因素对总鞣质提取率的影响，利用正交试验确定地榆总鞣质最佳提取工艺。结果：地榆鞣质的最佳提取工艺为：12倍量的40%的乙醇，超声提取2次，每次75min。在最佳条件下，提取率为9 113% 。结论：该工艺合理可行，重复性好，地榆鞣质的提取率高。
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关键词 地榆；鞣质；超声提取；正交试验
【中图分类号】R284 2【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517(2015)01-0027-03
地榆来源于蔷薇科植物地榆（Sanguisorba officinalis L.）或长叶地榆［Sanguisorba officinalis L.var. Longifolia (Bert.) Yǘ et Li］的干燥根，有凉血止血、解毒敛疮之功效，用于便血、痔血、水火烫伤，其炮制品已应用于临床。地榆含有多种化学成分，主要为鞣质、皂苷、黄酮类化合物，其中鞣质是主要的活性成分［1］。已有文献报道，地榆鞣质能收缩血管，缩短凝血时间［2］，在抗肿瘤［3］、提高免疫力［4］等方面都有较好疗效。
中药中鞣质的提取常采用渗漉、浸渍、热回流等方法，这些方法有一些缺点，如浸渍法、渗漉法提取时间长，不适合大量生产，而热回流法对热不稳定成分不宜使用。超声提取法近年来得到很大发展，它利用超声波产生的强烈振动、高加速度、空化现象［5］等效应，加速目标物进入溶剂，缩短提取时间，节省有机溶剂，且适合热敏性及氧化分解成分的提取［6］。本试验采用超声提取法，以鞣质提取率为指标，运用单因素试验及正交试验对鞣质提取影响因素进行考察，优化提取条件，为地榆鞣质的进一步开发利用提供依据。
1仪器和试剂
1 1仪器KQ3200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；UV-1800紫外可见光分光光度计（SHIMADZU CORPORATION）；HX1002T电子天平（慈溪市天东衡器厂）；TYS-100型高速多功能粉碎机（浙江省永康市红太阳机电有限公司）。
1 2试药生地榆饮片（购于湖北盛德堂中药饮片有限公司，由武汉大学张洪教授鉴定，且符合《中国药典》2010年版标准）；没食子酸对照品（批号：MUST-13040103，成都曼斯特生物科技有限公司）；干酪素（北京奥博星生物技术责任有限公司）；磷钼钨酸（自制）；水为双蒸水；其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2 1鞣质含量测定［7］
2 1 1溶液制备①磷钼钨酸试液：取钨酸钠100 g,钼酸钠25g，加水700ml，使溶解，加盐酸100ml、磷酸50ml，加热回流10h，加硫酸锂150g，水50ml，溴0 2ml，煮沸除去多余的溴，放冷，加水稀释至1000ml，过滤，即得。②29%碳酸钠试液：取无水碳酸钠145g，加水溶解，定容至500ml，即得。③对照品溶液：精密称取没食子酸对照品12 5mg,置25ml棕色容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，至50ml棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml中含有没食子酸0 05mg）。④供试品溶液：取样品液滤过，精密量取续滤液5ml置100ml棕色容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
2 1 2标准曲线绘制精密量取对照品溶液0 5、1 0、2 0m、3 0、4 0、5 0ml，分别置25ml棕色容量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分别加入水11 5、11 0、10 0、9 0、8 0、7 0ml，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30min，以相应试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2010年版一部附录VA）在760nm波长处测定吸光度。以吸光度（Y）为纵坐标，检测浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，结果见图1。经线性回归，得回归方程为Y=96 093X+0 0339，R2=0 9995。结果表明，没食子酸在1 0~10 0μg/ml范围内，线性关系良好。
2 1 3含量测定总酚量：精密吸取供试品溶液0 5ml,置25ml棕色量瓶中，照2 1 2项下方法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品中没食子酸的量（mg），即得。
不被吸附的多酚量：精密量取供试品溶液25ml，加至已盛有干酪素0 6g的具塞锥形瓶中，置30℃水浴中保温1h，时时振摇，取出，放冷，摇匀，过滤，精密取续滤液0 5ml，置25ml棕色量瓶中，按上述方法操作，测定吸光度，从标准曲线中读出供试品中没食子酸的量（mg），即得。
鞣质含量计算：鞣质的量（mg）＝总酚量-不被吸附的多酚量
2 2单因素实验
2 2 1提取溶剂对鞣质提取率的影响准确称取5g经粉碎后干燥的地榆粉11份，精密称定，分别加入10倍量的20%、30%、40%、60%、80%乙醇；20%、40%、60%、70%、80%丙酮及水，浸泡1h，室温，超声提取60min，过滤，滤液定容至250ml为样品液。按“2 1 3”项下方法测定，计算鞣质含量（鞣质含量=总鞣质质量/地榆质量×100%），结果见图2。
由图2可知：当乙醇浓度为30%时，鞣质提取率最高，乙醇浓度超过30%时，提取率有所下降；鞣质提取率随着丙酮浓度的升高而升高，在70%处达到最大，继续升高丙酮浓度，提取率有下降趋势，这可能是由于有机相浓度增加使鞣质的极性减弱不利于鞣质的溶出所致。由于鞣质提取率在30%乙醇和70%丙酮中提取率相差不大，又考虑到价格、环境及毒性，因此，提取溶剂为30%乙醇溶液较好。
2 2 2料液比对鞣质提取率的影响准确称取5g经粉碎后干燥的地榆粉，6份，分别加入5、8、10、12、15、20倍量30%乙醇，浸渍1h，室温，超声提取60min，过滤，滤液定容至250ml为样品液。按“2 1 3”项下方法测定，计算鞣质含量，结果见图3。
由图3可知：随着料液比增大，鞣质提取率升高，料液比为1∶10时提取效果最佳，而当大于1∶10时几乎保持不变，因此，料液比在1∶10 左右为宜。
2 2 3超声时间对鞣质提取率的影响准确称取5g经粉碎后干燥的地榆粉，5份，加入10倍量30%乙醇溶液，浸渍1h后，分别超声提取30、45、60、75、90min，过滤，滤液定容至250ml为样品液。按上述方法测定，计算鞣质含量，结果见图4。
由图4可知：提取率随着超声时间延长而升高，60min时提效果最佳，但随着超声时间继续延长，提取率反而有所下降，可能是由于超声波具有较强的机械剪切力，长时间的作用会使得鞣质结构破坏而影响提取率，因此，提取时间以60min左右为宜。
2 2 4超声提取次数对鞣质提取率的影响准确称取5g精粉粹后干燥的地榆粉，加入10倍量30%的乙醇溶液，浸渍1h后，分别超声提取1、2、3、4次，每次60min，过滤，滤液定容至250ml为样品液。按上述方法测定，计算鞣质含量，结果见图2-5。
由图5可知：提取次数对提取率有一定影响，提取3次后，地榆中鞣质已基本提取完全，再增加提取次数，提取率无显著增加，因此，以提取3次为宜。
2 3正交试验
在单因素实验的基础上，进一步选取乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数为主要考察因素（表1），采用4因素3水平L9（34）正交试验方案（表2），并对结果进行方差分析和显著性检验（表3），确定地榆总鞣质最佳提取工艺。
实验结果表明：以鞣质含量为评价指标，经直观分析可知，影响鞣质提取效率的因素顺序是D>C>A>B，最佳提取工艺条件为A3B3C3D2，即40%的乙醇，超声提取75min，料液比1∶12，提取2次。经方差分析可知，提取次数对超声提取工艺有一定影响（P<0 10），溶剂浓度、超声时间和料液比对提取效果影响较小。
2 4最佳提取工艺验证按正交试验结果，取地榆粉5g，加入12倍量40%乙醇溶液，浸渍1h，超声提取75min，提取2次，过滤，合并滤液并定容至250ml为样品液。按上述方法测定，计算鞣质含量，进行3次平行实验，实验结果表明总鞣质含量分别9 207%、9 176%和8 957%，平均含量为9 113%。
3讨论
研究根据《中国药典》2010 年版一部附录XB设计了鞣质含量测定方法，以没食子酸作对照品，采用紫外-分光光度法测定吸光度并绘制标准曲线。以地榆根为原料，将提取物中总鞣质的含量作为指标，通过单因素的考察确定每个因素的三个条件，以正交实验方法确定最佳提取工艺为12 倍量的40%乙醇，浸渍1h，超声提取2次，每次75min，经验证表明该工艺稳定可行。由于鞣质具有不稳定，极性强的特点，该工艺在室温下提取，且提取率高，时间短，有利于下一步鞣质的分离及纯化，对鞣质的进一步加工有很好的指导意义。
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参考文献
［1］夏红旻，孙立立，孙敬勇，等．地榆化学成分及药理活性研究进展［J］.食品与药品，2009，11(7)：67-69．
［2］姜贵全．地榆中药用活性成分提取工艺及稳定性研究［D］.哈尔滨：东北林业大学，2006.
［3］胡毅，夏天，赵建斌．地榆鞣质抗肝癌细胞SMMC-7721的MTT及FCM分析［J］.第四军医大学学报，1998，19(5)：550-552.
［4］杨金辉，杨明，黄晶，等．地榆鞣质的制备及其对环磷酰胺致小鼠白细胞减少症影响的初步研究［J］.中国医药生物技术，2013，8(1)：41-45.
［5］周淑芳，韩丽副，谢秀琼．现代中药制剂新技术［M］.北京：化学工业出版社，2004：30-31.
［6］李红然，付大友．五倍子中有效成分提取方法研究进展［J］.广东化工，2010，37(10)：71.
［7］国家药典委员会．中国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：附录99.
(收稿日期：2014 10 09)