摘 要：目的：探究荜茇生物碱对胰岛素抵抗的脂肪细胞葡萄糖摄取的影响。方法：将由3T3-L1前脂肪细胞分化来的脂肪细胞给予地塞米松诱导，建立胰岛素抵抗模型，将细胞分为正常组、胰岛素抵抗模型组、二甲双胍组、荜茇宁组、胡椒碱组。除正常组外其余各组使用地塞米松造模48小时，造模成功后分别按照分组进行给药，检测给药后葡萄糖消耗量的变化。结果：地塞米松造模48小时后，模型组的葡萄糖消耗量显著高于正常组，证明造模成功。之后对造模后的细胞进行药物干预，结果显示经过荜茇宁和胡椒碱处理后，给药组细胞培养基中葡萄糖消耗量较模型组均有所升高。结论：荜茇生物碱能通过增加3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的葡萄糖利用达到改善IR的作用。
关键词：胰岛素抵抗(Insulin-resistance,IR); 3T3-L1脂肪细胞; 荜茇生物碱;
Alkaloids from Piper Longum Improve Glucose Uptake in 3T3-L1 Adipocytes
ZHANG Yandong QIU Xiujuan YANG Yanmin ZHUANG Xinying
Yunnan University of Chinese Medicine
Abstract：
Objective: to investigate the effect of Piper longum alkaloid on glucose uptake of adipocytes with insulin resistance. Methods: the adipocytes differentiated from 3T3-L1 preadipocytes were given dexamethasone to induce insulin resistance model. The adipocytes were divided into normal group, insulin resistance model group, metformin group, piperlonguminine group and piperine group. Except for the normal group, the other groups were treated with dexamethasone for 48 hours. After successful modeling, the drug was administered according to groups, and the change of glucose consumption was detected after administration. Results:48 hours after dexamethasone was modeled, the glucose consumption of the model group was significantly higher than that of the normal group, which proved that the model was successful.Drug intervention was then performed on the modeled cells, and the results showed that after piperlonguminine and piperine treatment, the glucose consumption in the cell culture medium of the administration group was higher than that of the model group.Conclusion: the alkaloid of Piper longum can improve IR by increasing the glucose utilization of insulin resistance model of 3T3-L1 adipocytes.
Keyword：
insulin resistance; 3T3-L1 adipocytes; Piper longum alkaloid;
糖尿病作为以高血糖为特征的慢性代谢性疾病，可以由多种因素共同诱发，这种高血糖的状态不但对身体的各个组织有慢性损害，同时还可能导致一些组织发生功能障碍。而随着社会的不断发展以及人们生活水平的不断提高，我国糖尿病的患病率也正在逐年升高，调查显示自1980年至2013年间我国糖尿病患病率从0.67%飙升至了10.4%[1]，并且青少年的患病率存在逐年上升的趋势。这种日趋严峻的患病形势不但损害了我国国民的身体健康，更给我们带来了不小的经济负担和经济损失。如今在我国，糖尿病已经成为了仅次于心血管疾病和肿瘤的第三大非传染性疾病，据估计我国糖尿病患者数量已经超过1.2亿[2]。而其中95%为2型糖尿病（T2DM），并且2型糖尿病的发病情况呈逐渐加重的流行趋势[3]。胰岛素抵抗作为糖耐量减退、2型糖尿病和代谢综合征等疾病的发病基础[4,5]，已经成为了当代医学研究的热点。IR发生后，代偿性产生的大量胰岛素会对胰岛β细胞造成损害，使其功能减退，导致机体不能正常摄取和利用葡萄糖，最后形成2型糖尿病[6]。虽然以单靶点为基础开发的糖尿病药物在不断增多，但在治疗中仍然存在个体用药无效或因长期服用而导致耐药性的现象，严重者可能因药物而诱发低血糖、乳酸性酸中毒以及严重的心脑血管不良事件[7]。因此寻找有效且低毒的胰岛素抵抗治疗药物对糖尿病的控制有重要的意义，也是医药工作者的紧要任务。
脂肪组织作为体内胰岛素作用的关键靶点以及糖脂代谢发生的主要场所，其对胰岛素的敏感性很大程度上影响了人体对葡萄糖的摄取利用[8]。脂肪组织大体上可分为两类，白色脂肪组织和棕色脂肪组织，其中在白色脂肪组织里, 胰岛素发挥着抑制脂肪分解、提高葡萄糖的转运和促进脂肪生成的作用，当脂肪组织发生胰岛素抵抗时，糖、脂代谢都会受到负面影响[9]，可以说脂肪组织在IR过程中占有重要地位。因此本研究利用细胞培养技术，通过观察3T3-L1前脂肪细胞株分化为成熟脂肪细胞和诱导为胰岛素抵抗模型过程中形态的变化, 建立成功的脂肪细胞胰岛素抵抗模型。并在此基础上观察荜茇宁和胡椒碱对该IR模型葡萄糖摄取的影响，为临床上治疗糖尿病提供新的思路。
1材料和方法
1.1实验材料
1.1.1实验细胞株
3T3-L1前脂肪细胞株，购于中科院昆明动物所。
1.1.2主要试剂、仪器
试剂：DMEM高糖培养基（以色列BI公司），胎牛血清（FBS）（以色列BI公司），磷酸盐缓冲溶液（PBS）（以色列BI公司），青霉素-链霉素溶液（美国Hyclone公司），胰蛋白酶消化液（美国Hyclone公司），二甲基亚砜（DMSO）（北京索莱宝科技有限公司），胰岛素注射液（江苏万邦生化医药股份有限公司），地塞米松（美伦生物），3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）（美国Sigma公司），MTS试剂盒（美国Promega公司），葡萄糖测定试剂盒（中生北控生物科技有限公司），油红O（北京索莱宝科技有限公司），10%中性甲醛（北京索莱宝科技有限公司），异丙醇 （天津市风船化学试剂有限公司），胡椒碱（中国生物制品检定所），荜茇宁（课题组合成），二甲双胍（MET）（中美上海施贵宝制药有限公司）
仪器：CO2培养箱（日本Sanyo科技有限公司），倒置荧光显微镜ECLIPSE TS100（日本Nikon公司），台式离心机AllegraX-22（美国Beckman Coulter有限公司），酶标仪SPECTRAMAX PLUS384（美国Molecular Devices公司），D2012型PLUS高速小型离心机（大龙医疗器械有限公司），十万分之一电子分析天平AB265-S（METTLER TOLEDO公司），恒温水浴锅（北京永光明医疗器械厂），超净工作台SW-CJ-1F型（苏州安泰空气技术有限公司），Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司），RO纯水机（美国Biogen公司）QL-861型漩涡混匀器（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。
1.2实验方法
1.2.1试剂的制备
（1）荜茇宁（GBN）母液：GBN纯度为98.00%，相对分子量为273.00。精密称取GBN粉末19.11mg，溶于1mL的DMSO中，配制成GBN母液，母液浓度为70mmol/L，使用0.22μm滤膜过滤除菌，在-20℃可长期保存。给药前用DMEM高糖完全培养基稀释至实验所需浓度，并保证最高浓度的GBN溶液中DMSO终浓度不高于0.1%。
（2）胡椒碱（PIP）母液：PIP纯度为98.08%，相对分子量为258.34。精密称取PIP 粉末10.50mg，使其完全溶解在1mL的DMSO中，配制成40mmol/L的PIP母液，使用0.22μm滤膜过滤除菌，可在-20℃长期保存。临用前用DMEM高糖完全培养基稀释至实验所需浓度，并保证最高浓度的PIP溶液中DMSO终浓度不超过0.1%。
（3）二甲双胍（MET）母液：取中美上海施贵宝制药有限公司生产的盐酸二甲双胍一片（含二甲双胍0.50g，分子量165.63），溶于30mL超纯水中，配制成100mmol/L的MET母液，使用0.22μm滤膜过滤除菌后，对其进行分装和密封，可于-20℃长期保存。给药前用DMEM高糖完全培养基稀释至实验所需浓度。
（4）地塞米松母液：地塞米松的相对分子量为392.46。精确称取地塞米松3.93mg，溶于10ml无水乙醇中，配制成1mmol/L的母液，使用0.22μm滤膜过滤除菌，进行分装并密封，于-20℃长期保存，使用前利用DMEM高糖完全培养基稀释至所需浓度。
（5）3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）母液：IBMX的相对分子量为：222.24。精确称取10mg IBMX，加入847μl超纯水和54μl氢氧化钠溶液（1mol/L），于37℃水浴中溶解，配制成50mmol/L的母液，使用0.22μm滤膜过滤除菌，于-20℃长期保存，使用前利用DMEM高糖完全培养基稀释至所需浓度。
1.2.2 造模液配制
用移液枪吸取100μl地塞米松母液，置于100ml常规培养基中，混匀，使地塞米松终浓度为1μmol/L，封口，4℃保存。
1.2.3 3T3-L1前脂肪细胞的培养及诱导分化
3T3-L1前脂肪细胞为贴壁细胞，使用添加了10％的FBS和1％的青霉素-链霉素溶液的DMEM高糖培养基，放入37℃、5% CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，将生长状态良好的细胞以1×105个每孔的密度接种于6孔板，待细胞生长至接触抑制状态，更换培养基为含有0.5mmol/L IBMX、1μmol/L地塞米松和10mg/L胰岛素的DMEM高糖完全培养基继续培养4天后，于显微镜下观察，当细胞出现皱缩，弃去培养液，更换为含有10mg/L胰岛素的DMEM高糖完全培养基再培养4天并于显微镜下观察，当细胞形态变大变圆时，弃去培养液，换为普通的DMEM高糖完全培养基培养，每2天换液一次，待15天诱导结束时在显微镜下观察可发现：细胞变圆、变亮,且在细胞质中出现大量圆形脂滴聚集。弃去原先培养基并用PBS小心的清洗3次，每孔加入2ml 10％中性甲醛溶液固定15min左右，固定结束后用PBS清洗，洗净固定液，加入油红O染色剂染色20min左右，吸弃染色剂并用PBS洗涤2~5次，直至洗去剩余染色剂，置于显微镜下观察并拍照。
1.2.4建立脂肪细胞IR模型
将诱导分化成熟的脂肪细胞用PBS清洗后换为无血清的高糖DMEM培养基饥饿培养12h，分别设置正常组和模型组，正常组用常规培养基正常培养，模型组用含终浓度为1μmol/L地塞米松的常规培养基造模培养48h。造模结束后，收集各孔细胞上清液，根据葡萄糖测定试剂盒（葡萄糖氧化酶法）的检测说明书计算两组细胞的葡萄糖消耗量，当两组细胞间葡萄糖的消耗量差异有统计学意义时 (P<0.05) , 证明造模成功，并利用该造模条件进行接下来的药物作用实验。
1.2.5 MTS法检测药物对3T3-L1脂肪细胞活率的影响
将处在对数生长期的3T3-L1细胞以每孔1×104个的密度接种传至96孔板，放入CO2培养箱中培养24h后，弃去培养基，按照浓度梯度分别配制不同浓度的含胡椒碱或荜茇宁的培养液（浓度梯度为1.25，2.5，5，10，20，40，80，160μmol/L）。设置空白组（只加不含细胞的常规培养基）、对照组（只加含细胞的常规培养基）和不同浓度药物干预组，每孔200μL，培养细胞24h后，每100μL培养基加20μL MTS溶液，培养箱孵育1h后，置于摇床上振摇10min并用酶标仪测定波长490nm处的吸光度，根据吸光度计算每组细胞的存活率，从而确定药物的给药浓度。
1.2.6药物对IR脂肪细胞葡萄糖消耗量的影响
将细胞分为正常组（N组）、胰岛素抵抗模型组（M组）、二甲双胍组（MET组）、荜茇宁组（GBN组）、胡椒碱组（PIP组）其中MET组选用2mmol/L二甲双胍溶液作为阳性药的给药浓度，而GBN组和PIP组均选用10μmol/L作为给药浓度。分别作用24h和48h后，收集细胞上清，利用葡萄糖氧化酶法检测两个时间段内各组葡萄糖消耗量的变化情况，以探讨GBN、PIP对脂肪细胞IR模型糖消耗的影响。
1.3统计学分析
用统计学分析软件GraphPad Prism 5.0整理分析数据，实验数据采用均值±标准差（±s）表示。组间差异比较用t检验，方差不齐用非参数检验，多组间比较用单因素方差分析，P<0.05，即认为差异具有统计学意义。
2实验结果
2.1 3T3-L1前脂肪细胞分化结果鉴定
正常生长状态下的3T3-L1前脂肪细胞呈长梭形贴壁生长，细胞体积小、间质少，胞腔中未见脂滴，诱导分化后细胞呈圆形,当分化为成熟脂肪细胞后,细胞内脂滴明显,分布于细胞核周围,油红O染色后,可明显观察到红色脂滴，见图1。
2.2 GBN对脂肪细胞活率的影响
实验结果显示，GBN浓度≤10μmol/L时，细胞活率在85％以上，对细胞影响较小（见表1和图2）；因此选择对细胞活率影响较小的10μmol/L作为后续实验中GBN的给药浓度。
表1 不同浓度GBN作用24h后的细胞存活率（n=6，±s）
2.3 PIP对脂肪细胞活率的影响
观察PIP对脂肪细胞增殖的影响结果，发现PIP浓度≤ 10μmol/L时，细胞活率在90％以上，对细胞影响较小（见表2和图3）；同时为对比两种成分的治疗效果，所以采用与GBN相同的浓度10μmol/L作为后续实验中PIP的给药浓度。
表2 不同浓度PIP作用24h后的细胞存活率
2.4 GBN、PIP对脂肪细胞IR模型葡萄糖消耗量的影响
2.4.1 脂肪细胞IR细胞模型的鉴定
造模剂作用于脂肪细胞48h后，模型组细胞葡萄糖消耗量与正常组相比，显著下降（P<0.01），表明脂肪细胞IR模型建立成功（见表3，图4）。
2.4.2 GBN、PIP对脂肪细胞IR模型葡萄糖消耗量的影响
GBN、PIP干预24h：与正常组比较，M组的葡萄糖消耗量显著降低（P<0.05）；与M组比较，阳性药MET组葡萄糖消耗量显著上升（P<0.01）；GBN组和PIP组葡萄糖消耗量与M组比较有上升趋势，但差异不显著，同时PIP组葡萄糖消耗量略高于GBN组，但不显著，见表4、图5。
GBN、PIP干预48h：与正常组比较，模型组葡萄糖消耗量显著降低（P<0.001）；与M组比较，阳性药MET组葡萄糖消耗量显著上升（P<0.001），GBN组和PIP组葡萄糖消耗量也显著上升（P<0.01），与GBN组进行比较，PIP组葡萄糖消耗量略高，但未见显著性差异，见表5、图6。
3讨论
胰岛素抵抗的发生主要是因为血液中胰岛素的生物效应下降，外周组织对胰岛素的敏感性也同时降低，进而无法正常摄取和利用葡萄糖。作为胰岛素重要的靶器官，脂肪组织不但是重要的能量储备系统，还是重要的内分泌器官，它所分泌的多种活性物质可以通过自分泌、旁分泌、内分泌途径参与到糖脂代谢调节中[10]。并且研究发现脂肪胰岛素抵抗在2型糖尿病发生发展中起着非常关键的作用[11],因此加强药物对脂肪IR作用的研究对糖尿病防治具有重要意义。考虑到细胞模型相较于动物模型有更好的重复性，并且具有更易控制外界影响因素的优点，所以本实验选择了对胰岛素敏感性高，具有良好稳定性和活性的3T3-L1前脂肪细胞建立稳定的脂肪IR细胞模型，它也是目前国内外用于脂肪细胞功能及糖脂代谢障碍的病理生理学研究的主要细胞系[12,13,14]。实验中选用地塞米松诱导IR模型是因为该模型适合慢性胰岛素抵抗的发生条件，在实验中常常用来对IR药物进行评价[15]。
二甲双胍是临床治疗T2DM的常用药物，具有改善胰岛素敏感性，促进葡萄糖吸收，减少糖异生，降低肝糖元产生等作用，其在降低血糖的同时对糖尿病慢性并发症也有一定益处。作为如今的降糖首选药，其活性主要是通过激活AMPK信号通路来发挥作用的[16,17]。因此本实验选用二甲双胍作为阳性药，可以有效的评价实验整体方案的可行性。
中药荜茇属于胡椒科胡椒属植物, 性味辛、热，具温中散寒, 下气止痛的作用,其不但是我国传统中、蒙、藏、维医等常用药,在印度药中也有广泛的应用[18]。在中医和蒙医中常利用荜茇温热的药性来祛除胃寒，治疗脾胃虚寒症，但除此之外，蒙医还认为荜茇有滋补强壮、祛痰平喘的功效[19]。近年对荜茇的现代研究发现其具有多种功效，包括抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、保肝和调节体内代谢的作用[18]。胡椒碱、荜茇宁、荜茇酰胺和荜茇环碱作为荜茇中主要的生物碱成分，也被证明具有降低血脂和改善动脉粥样硬化的作用。在这些生物碱中荜茇宁具有良好的降脂功效，而胡椒碱可降低IR大鼠血糖、血压并增强外周组织胰岛素敏感性[20]。并且在前期研究中我们发现GBN和PIP能改善C2C12细胞IR模型和HepG2细胞IR模型的糖代谢紊乱，同时胡椒碱能够提高高脂饮食喂养的大鼠骨骼肌线粒体DNA拷贝数，增加骨骼肌PGC-1α的表达，具有良好的调节IR和代谢异常作用。因此本实验选用荜茇宁与胡椒碱作受试药物，采用MTS法确定药物的无毒范围，运用葡萄糖氧化酶法检测各给药组葡萄糖含量，探究荜茇宁与胡椒碱对3T3-L1脂肪细胞IR模型的影响。实验结果显示，荜茇宁与胡椒碱可显著降低IR细胞培养液中葡萄糖含量，即增强细胞对葡萄糖的摄取和利用，从而改善脂肪细胞胰岛素抵抗。
目前用于糖尿病治疗的药物多针对单一症状，如侧重降糖、降脂或增加胰岛素敏感性。单从治疗效果看，西药虽然降糖效果显著，但对并发症的控制效果一般，同时存在不良反应大和长期服用损害患者机体的缺点。而反观中药，其治疗IR更加注重整体性，具有多靶点、多向性的药理学作用优势。其治疗IR的分子机制研究也在近年来取得了令人欣慰的成绩：研究发现葛根素可能通过上调脂肪细胞中P13K、AKT、AMPK、PPARγ基因和蛋白表达，进而增强GLUT4对葡萄糖的转运功能，增强脂肪细胞对葡萄糖的摄取和利用，从而改善IR[21]；黄连素也能通过多种途径发挥调控糖脂代谢、改善胰岛素抵抗的作用[22]。正是这些研究成果不断地肯定着中药在治疗IR方面的优势，而荜茇作为中药和民族药物的独特代表，其有效成分的应用对充分开发和利用我国特色药物资源也具有重要意义。
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