摘 要：目的 探讨金黄色葡萄球菌SaeRS二元调控系统在人血浆蛋白调控细菌凝集和生物被膜形成中的作用机制。方法 收集金黄色葡萄球菌感染常见的临床克隆菌株，Newman(NM)菌株中由于SaeS第一个跨膜区点突变(L18P)导致SaeRS二元调控系统处于持续活化状态，为了探索不同菌株中SaeRS系统的调控功能，本研究分别以USA300和NM菌株为背景，构建SaeRS二元调控系统敲除菌株USA300Δsae和NMΔsae,在含有乏血小板血浆(PPP)和富血小板血浆(PRP)条件下分别检测不同菌株凝集和生物被膜形成的能力。采用反转录-聚合酶链反应检测不同菌株在PPP作用后其SaeRS二元调控系统调控的靶基因表达水平。结果 人血浆PPP可促进金黄色葡萄球菌不同临床分离菌株凝集，人血浆PPP和PRP均可促进金黄色葡萄球菌不同临床分离菌株生物被膜形成，但不同菌株之间存在差异，如人血浆蛋白促进NM菌株凝集能力明显强于USA300菌株，提示NM菌株中SaeRS系统的高度活化状态可能参与血浆蛋白促进细菌的凝集过程。进一步研究发现，人血浆蛋白不能促进sae敲除菌株的凝集和生物被膜形成能力；sae敲除菌株中互补表达SaeRS和高度活化状态的SaeRS L18P均可回复人血浆蛋白促进细菌凝集活性；USA300菌株中SaeRS通过调控凝固酶coa表达促进金黄色葡萄球菌凝集和生物被膜形成，而在NM菌株中，高度活化的SaeRS二元调控系统通过调节多个基因(coa、eap、clfb、emp)的表达发挥功能。结论 人血浆蛋白可促进金黄色葡萄球菌凝集和生物被膜形成，SaeRS二元调控系统单个氨基酸位点突变改变该系统的调控网络。
关键词：金黄色葡萄球菌 SaeRS二元调控系统 细菌凝集 生物被膜
Staphylococcus aureus SaeRS binary regulatory system promotes bacterial aggregation and biofilm formation
HU Liuping LIU Qian
Department of Clinical Laboratory,Renji Hospital,Shanghai JiaoTong University School of Medicine;
Abstract：Objective To explore the mechanism of the Staphylococcus aureus SaeRS binary regulation system in the regulation of bacterial aggregation and biofilm formation of human plasma proteins.Methods Collected common clinical cloned strains of Staphylococcus aureus infection, in the Newman(NM) strain, the SaeRS binary regulation system was continuously activated due to a point mutation in the first transmembrane region of SaeS(L18 P).In order to explore the regulatory functions of the SaeRS system in different strains, this study used the USA300 and NM strains as the background to construct the SaeRS binary regulatory system knockout strains USA300Δsae and NMΔsae.Under the conditions of platelet-poor plasma(PPP) and platelet-rich plasma(PRP),the ability of different strains to aggregate and form biofilm was detected respectively.Reverse transcription-polymerase chain reaction was used to detect the expression levels of target genes regulated by the SaeRS binary regulatory system of different strains after PPP action.Results Human plasma PPP could promote the agglutination of different clinical isolated strains of Staphylococcus aureus, and both human plasma PPP and PRP could promote the biofilm formation of different clinical isolated strains of Staphylococcus aureus, but there were differences between different strains.For example, the ability of human plasma protein to promote the agglutination of the NM strain was significantly stronger than that of the USA300 strain, suggested that the highly activated state of the SaeRS system in the NM strain might be involved in the process of plasma protein promoting the agglutination of bacteria.Further research found that human plasma protein could not promote the agglutination and biofilm formation ability of sae knockout strains.The complementary expression of SaeRS and the highly activated SaeRS L18 P in the sae knockout strain could restore the pro-bacterial agglutination activity of human plasma proteins.In the USA300 strain, SaeRS promoted Staphylococcus aureus agglutination and biofilm formation by regulating the expression of coagulase coa,while in the NM strain, the highly activated SaeRS binary regulatory system functions by regulating the expression of multiple genes(coa,eap,clfb,emp).Conclusion Human plasma protein could promote the agglutination and biofilm formation of Staphylococcus aureus.The mutation of a single amino acid site in the SaeRS binary regulatory system changes the regulatory network of the system.
Keyword：Staphylococcus aureus; SaeRS binary regulatory system; bacterial aggregation; biofilm;
金黄色葡萄球菌是一种可以引起人类和动物多种感染性疾病的革兰阳性菌，其致病性与细菌的凝集反应和生物被膜形成密切相关，细菌通过复杂的调控系统调节这些参与细菌凝集和生物被膜形成的毒力因子表达。据报道，金黄色葡萄球菌ArlRS二元调控系统调节ebh基因转录表达，抑制葡萄球菌表面蛋白表达，促进凝集[1]。SaeRS二元调控系统在细菌致病过程中发挥重要作用[2-4]。目前，关于SaeRS调控细菌生物被膜的分子机制尚有争议，在不同菌株中调控方式不同[5-8]。有研究发现，Newman(NM)菌株中由于SaeS第一个跨膜区点突变(L18P)导致其调控网络发生改变，从而影响细胞外黏附蛋白eap表达，促进细菌凝集，但在USA300菌株中并未发生这种变化[9],提示金黄色葡萄球菌不同菌株调控方式不同。本研究通过外源性加入人血浆蛋白，探讨不同金黄色葡萄球菌菌株的SaeRS在人血浆蛋白促进细菌凝集和生物被膜形成中的作用。有研究发现，人血浆蛋白通过促进SaeRS调控靶基因的表达，促进金黄色葡萄球菌的凝集和生物被膜形成[10];SaeRS突变影响其调控方式，如在USA300菌株中，人血浆蛋白促进凝固酶coa的高表达促进细菌凝集；在NM菌株中，由于SaeS点突变，人血浆蛋白调控细菌凝集机制存在差异。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 菌株
USA300、NM、ST398 09-1059、ST239 09-770、ST59 RJ2、ST9 2014-58、ST5 05-72、NMΔcoa、USA300Δcoa、NMΔeap和USA300Δeap。
1.1.2 人血浆蛋白制备
收集10例健康体检人员的静脉抗凝(枸橼酸钠)血，男、女各5例，平均年龄29.9岁。排除标准：(1)患有全身性疾病和感染；(2)血红蛋白水平低于110 g/L;(3)血小板计数低于150×109/L;(4)有吸烟习惯和在采血前5 d内服用非甾体抗炎药物。收集每例健康体检人员2.7 mL静脉血，每管含有0.3 mL枸橼酸钠溶液作为抗凝血剂。460×g离心8 min, 乏血小板血浆(PPP)、富血小板血浆(PRP)、浓缩红细胞分层[10]。在无菌条件下，每管PPP约0.3 mL,位于分层溶液的顶部被抽吸。然后小心地收集位于红细胞颗粒上的类似体积的PRP,以避免白细胞混入。PRP中血小板计数为285(183,386)×109/L;PPP中血小板计数为6(4,7)×109/L。血小板检测采用Sysmex XN2800全自动血细胞分析仪。
1.2 仪器与试剂
Molecular Devices SpectraMax250酶标仪；ABI7500实时荧光定量聚合酶链反应仪；气浴恒温振荡器(SHZ-82);胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB);RNeasy Mini Kit RNA 抽提试剂盒；Reverse Transcription Kit试剂盒。
1.3 生物被膜形成与测定
所用培养基为TSB(30 g/L)添加0.5%葡萄糖注射液。接种前预先在96孔板微滴板上加入200 μL 20%的健康人PPP,并在4 ℃下孵育过夜。弃上清液加入200 μL新配置的菌悬液后，盖上盖子，于37 ℃条件下恒温恒湿培养24 h, 弃去96孔板中的培养物，用200 μL无菌磷酸盐缓冲液(PBS,pH值7.3)冲洗3次，去除培养基和浮游状态的细菌。在96孔板中每个孔加入乙醇200 μL加盖静置15 min, 吸除乙醇后在30 ℃环境下自然风干，固定生物膜。然后在每个孔中加入1滴1%结晶紫溶液，静置染色30 min后弃去染色液，用水冲洗直至无色，晾干。在染色的孔中加入200 μL 5%冰乙酸溶液，以200 μL 5%冰乙酸溶液作为空白孔，测定各个检测孔590 nm波长的吸光度值(A值)。
1.4 细菌凝集实验
挑取血平板上单个菌落于3 mL TSB 培养基中振荡培养过夜，然后吸取80 μL 菌液加入到8 mL TSB培养基中继续振荡培养4 h, PBS洗涤3次后配置成A值为1.0的菌悬液2管，其中一管加入2.5%的PPP,室温静置培养2 h, 每隔15 min吸取上清液检测A600值直至2 h。
1.5 反转录-聚合酶链反应
分别收集NM和USA300及其敲除sae 菌株对数生长期(2 h)的菌落，加入磁珠管内用破碎机振荡2次(频率：1 600次/分)进行金黄色葡萄球菌破壁，然后用RNeasy Mini Kit RNA抽提试剂盒提取RNA。利用IDT在线软件根据已发表的金黄色葡萄球菌序列设计emp、eap、clfb、coa、gyrb引物，寡核苷酸引物序列见表1。取1 μg RNA配成7 μL体系用HifairTM Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)进行反转录得到cDNA;然后取2.5 μL cDNA加入22.5 μL[引物+SYBR Green Master(ROX)+H2O]体系中，采用ABI7500实时荧光定量聚合酶链反应仪进行扩增，条件如下：50 ℃ 2 min, 94 ℃ 15 min, 40个循环(94 ℃ 15 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 32 s),绘制解离曲线(95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 15 s)。所有标本均重复3次，以gyrb作为参考基因。
表1 引物序列
1.6 统计学处理
采用GraphPad Prism5软件分析实验结果并绘制图表。组间差异采用单因素方差分析进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 金黄色葡萄球菌凝集和生物被膜形成检测
首先通过外源性加入人血浆蛋白，体外检测细菌凝集和生物被膜的形成。收集目前金黄色葡萄球菌临床感染不同ST分型的临床分离株(ST398 09-1059、ST239 09-770、ST59 RJ2、ST9 2014-58、ST5 05-72)和2株实验室菌株UAS300和NM。加入PPP血浆蛋白进行检测，结果显示，在培养细菌中加入PPP,所有检测的金黄色葡萄球菌菌株相对于PBS对照组，均表现出更强的凝集效应。PPP促进不同菌株的凝集表型有差异，PPP促进NM菌株凝集能力最强，而ST398 09-1059凝集能力最弱(图1A),提示人血浆蛋白可以促进金黄色葡萄球菌的凝集发生，但不同临床分离菌株中存在差异。细菌凝集和生物被膜的形成密切相关，本研究进一步在人血浆蛋白中搭建了观察金黄色葡萄球菌的生物被膜形成的检测体系显示，无论是在培养基中加入PRP或PPP,所有检测的金黄色葡萄球菌体外生物被膜形成能力均明显增强(图1B),提示人血浆蛋白促进金黄色葡萄球菌生物被膜形成具有广谱性。
图1 人血浆蛋白促进金黄色葡萄球菌的凝集和 生物膜形成
2.2 人血浆蛋白通过调控SaeRS二元调控系统促进细菌凝集和生物被膜形成
本研究分别向NM和USA300菌株的PBS培养基中加入PPP,在PPP组这两种菌株均出现了凝集效应，NM菌株的凝集效果明显强于USA300菌株。在NM和USA300菌株中引入sae基因突变后，对应的凝集效应均明显降低。结果显示，sae的存在能够明显影响金黄色葡萄球菌的凝集能力(图2A)。进一步通过体外生物被膜研究发现，人血浆蛋白不能促进NMΔsae或者是USA300Δsae敲除菌株的生物被膜形成(图2B)。为了进一步证实SaeRS调控细菌凝集过程，本研究在NMΔsae菌株中分别回补SaeRS和SaeRS L18P的表达，构建了互补菌株NMpSaeRS和NMpSaeRS L18P。本研究显示，SaeRS和SaeRS L18P菌株在人血浆蛋白中均可回复sae敲除菌株细菌凝集活性，并且回复活化状态的SaeRS L18P的菌株，其凝集活性明显强于pSaeRS(图3),进一步证实人血浆蛋白通过调控SaeRS二元调控系统影响细菌凝集，NM菌株中SaeRS系统的高度活化导致NM菌株的高度凝集状态。
图2 sae敲除菌株在人血浆中凝集和生物膜形成能力
图3 SaeRS和SaeRS L18P回复sae敲除菌凝集活性
2.3 人血浆蛋白调控coa和eap敲除菌株凝集检测
为了探讨在不同菌株中人血浆蛋白调控SaeRS系统的分子机制，本研究分别构建了SaeRS系统调控的靶基因coa和eap敲除菌株并检测其凝集活性，研究发现，PPP可以促进NMΔcoa敲除菌株的凝集活性，但不能促进USA300Δcoa敲除菌株的凝集活性，PPP仍然可以促进NMΔeap和USA300Δeap敲除菌株的凝集活性，见图4A、4B。
图4 金黄色葡萄球菌coa和eap敲除菌株在人血浆蛋白 中的凝集表型
2.4 金黄色葡萄球菌在人血浆蛋白作用时不同基因转录表达水平
USA300菌株SaeRS可能通过调控靶基因coa的表达发挥功能，但是NM菌株中SaeRS靶基因coa和eap敲除后均不影响人血浆蛋白对细菌凝集表型的影响。为了进一步探讨人血浆蛋白调控细菌凝集的分子机制，本研究进一步检测了人血浆蛋白作用下USA300和NM菌株中SaeRS调控靶基因的表达水平，结果表明，USA300菌株中人血浆蛋白明显促进coa基因的转录表达，而在NM菌株中人血浆蛋白作用下，SaeRS调控的多个靶基因(coa、eap、clfb、emp)的转录表达水平均明显增强。见图5。
图5 金黄色葡萄球菌在人血浆蛋白作用时不同基因转录表达水平
3 讨 论
金黄色葡萄球菌可以利用宿主血浆蛋白促进自身凝集，本研究发现，人血浆蛋白可促进金黄色葡萄球菌不同来源的临床分离菌株的凝集及生物被膜形成，但是不同临床分离菌株对人血浆蛋白的效果不同。据报道，NM菌株中SaeRS L18P点突变使其处于高度活化状态[11-13]。本研究发现，人血浆蛋白促进NM菌株凝集活性最强，推测是否是因为SaeRS二元调控系统高度活化导致的这种现象，进一步分别以USA300和NM 为背景构建sae敲除菌株发现，在NM和USA300菌株中引入sae基因突变后，对应的凝集效应和生物被膜形成能力均明显降低，提示SaeRS二元调控系统在人血浆蛋白促进细菌凝集和生物被膜形成过程中发挥重要作用。
据报道，金黄色葡萄球菌SaeRS调控系统的靶基因coa可促进细菌凝集[14]。NM菌株中三磷酸腺苷依赖蛋白酶FtsH通过促进SaeRS靶基因eap的高表达促进细菌凝集[9]。本研究发现，SaeRS二元调控系统在不同菌株中通过调控靶基因的转录表达，从而影响细菌凝集和生物被膜形成。在USA300菌株中人血浆蛋白主要通过调控SaeRS调控因子coa的表达促进细菌凝集，但在NM菌株中人血浆蛋白调控SaeRS下游eap的表达并不是促进细菌凝集的唯一机制，人血浆蛋白可能通过调控SaeRS下游多个靶基因的表达协同作用而促进细菌凝集。
细菌的凝集反应和生物被膜形成与金黄色葡萄球菌的致病性密切相关[15-16],但SaeRS调控细菌生物被膜的分子机制尚有争议。PAHARIK等[17]研究发现，SaeRS通过促进核酸酶表达降解细菌DNA抑制生物被膜形成。本研究通过对不同临床分离菌株研究发现，人血浆蛋白通过SaeRS二元调控系统调节细菌凝集和生物被膜形成。本研究利用人血浆蛋白成功建立了用于检测金黄色葡萄球菌的凝集活性和生物被膜形成的体系，具体通过检测A值及相应百分比进行量化。本研究分别采用两种不同的血浆蛋白进行作用，结果表明，人血浆蛋白促进金黄色葡萄球菌凝集发生和生物被膜的形成具有广谱性，并且与血浆中血小板无关，提示主要是因为人纤维蛋白原在这个过程中发挥功能。进一步研究发现，由于SaeRS二元调控系统活性变化会导致人血浆蛋白调控机制发生改变。NM菌株中SaeS的点突变导致SaeRS系统呈高活化状态时，人血浆蛋白调控机制发生变化，提示毒力调控蛋白单个氨基酸改变可以导致整个调控网络的变化。
据报道，凝固酶通过降解宿主纤维蛋白原转变为纤维蛋白促进细菌凝集和生物被膜形成[18]。本研究发现，NM菌株中SaeRS对coa的调控并不是其唯一的调控机制，一方面提示细菌中还有其他毒力因子参与宿主蛋白相互作用；另一方面提示宿主其他一些未知血浆蛋白也参与细菌的凝集过程。后期需要通过构建可能参与凝集的细菌毒力因子多敲除菌株进一步探寻细菌与宿主相互作用的主要分子，为治疗金黄色葡萄球菌感染提供新的药物靶标及理论依据。
[1] WALKER J N,CROSBY H A,SPAULDING A R,et al.The Staphylococcus aureus ArlRS two-component system is a novel regulator of agglutination and pathogenesis[J].PLoS Pathog,2013,9(12):e1003819.
[2] BAE I G,KIM J S,KIM S,et al.Genetic correlation of community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains from carriers and from patients with clinical infection in one region of korea[J].J Korean Med sci,2010,25(2):197-202.
[3] BROWN S,SANTA MARIA J P,WALKER S.Wall teichoic acids of gram-positive bacteria[J].Annu Rev Microbiol,2013,67(3):313-336.
[4] BUFFIE C G,BUCCI V,STEIN R R,et al.Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to clostridium difficile[J].Nature,2015,517(7533):205-208.
[5] ADHIKARI R P,NOVICK R P.Regulatory organization of the Staphylococcal sae locus[J].Microbiology (Reading),2008,154(3):949-959.
[6] SCHAFER D,LAM T T,GEIGER T,et al.A point mutation in the sensor histidine kinase SaeS of Staphylococcus aureus strain newman alters the response to biocide exposure[J].J Bacteriol,2009,191(23):7306-7314.
[7] COOK L C,LASARRE B,FEDERLE M J.Interspecies communication among commensal and pathogenic streptococci[J].MBio,2013,4(4):e00382-13.
[8] ZAPOTOCZNA M,MCCARTHY H,RUDKIN J K,et al.An essential role for coagulase in Staphylococcus aureus biofilm development reveals new therapeutic possibilities for device-related infections[J].J Infect Dis,2015,212(12):1883-1893.
[9] LIU Q,HU M,YEO W S,et al.Rewiring of the FtsH regulatory network by a single nucleotide change in saeS of Staphylococcus aureus[J].Sci Rep,2017,7(1):8456-8459.
[10] MARIANI E,FILARDO G,CANELLA V,et al.Platelet-rich plasma affects bacterial growth in vitro[J].Cytotherapy,2014,16(9):1294-1304.
[11] GEIGER T,GOERKE C,MAINIERO M,et al.The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus:promoter activities and response to phagocytosis-related signals[J].J Bacteriol,2008,190(10):3419-3428.
[12] JEONG D W,CHO H,LEE H,et al.Identification of the P3 promoter and distinct roles of the two promoters of the SaeRS two-component system in Staphylococcus aureus[J].J Bacteriol,2011,193(18):4672-4684.
[13] MAINIERO M,GOERKE C,GEIGER T,et al.Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS[J].J Bacteriol,2010,192(3):613-623.
[14] MCADOW M,KIM H K,DEDENT A C,et al.Preventing Staphylococcus aureus sepsis through the inhibition of its agglutination in blood[J].PLoS Pathog,2011,7(10):e1002307.
[15] DASTGHEYB S,PARVIZI J,SHAPIRO I M,et al.Effect of biofilms on recalcitrance of Staphylococcal joint infection to antibiotic treatment[J].J Infect Dis,2015,211(4):641-650.
[16] SPEZIALE P,PIETROCOLA G,FOSTER T J,et al.Protein-based biofilm matrices in Staphylococci[J].Front Cell Infect Microbiol,2014,4(1):171-179.
[17] PAHARIK A E,HORSWILL A R.The Staphylococcal biofilm:adhesins,regulation,and host response[J].Microbiol Spectr,2016,4(2):10-18.
[18] CROSBY H A,KWIECINSKI J,HORSWILL A R,et al.Staphylococcus aureus aggregation and coagulation mechanisms,and their function in hoste pathogen interactions[J].Adv Appl Microbiol,2016,96:1-41.