摘 要：目的 增生性瘢痕是一种真皮纤维增生性疾病。A型肉毒毒素具有预防增生性瘢痕形成的作用，但其抗皮肤纤维化的作用及其机制尚不清楚。本研究分析A型肉毒毒素(BTXA)对增生性瘢痕(HS)JNK信号通路和成纤维细胞相关蛋白表达的影响。方法 本研究采用0、1、2、4U/ml BTXA对人瘢痕成纤维细胞进行干预，通过CCK8划痕法、荧光定量PCR和western印迹法检测不同浓度BTXA对HS成纤维细胞增殖、迁移、细胞凋亡和蛋白表达的变化。并对比BTXA干预前后转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CTGF)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路、磷酸化氨基末端激酶(p-JNK)等成纤维细胞相关蛋白表达的变化。结果 与无BTXA干预相比，1、2、4U/ml BTXA干预后HS成纤维细胞增殖能力较低(P<0.05)；与无BTXA干预相比，1、2、4U/ml BTXA干预后HS成纤维细胞凋亡率增高(P<0.05)；与BTXA干预前相比，BTXA干预后TGF-β1、α-SMA、CTGF等基因水平和蛋白水平均降低(P<0.05)；与JNK选择性抑制SP600125干预前相比，JNK选择性抑制SP600125干预后p-JNK表达较高(P<0.05)。结论 BTXA可影响HS患者成纤维细胞增殖、迁移和凋亡，并能通过JNK信号通路诱导成纤维细胞凋亡，调控其相关蛋白表达，为临床治疗提供新靶点。
关键词：增生性瘢痕; A型肉毒毒素; JNK信号通路;成纤维细胞蛋白;细胞增生周期;细胞凋亡率;
作者简介：郭彩茹(1982-)，主管技师，硕士研究生;*李明鸣，E-mail:lyszxyylmm@163.com;
增生性瘢痕(Hypertrophic scar，HS)为纤维变性疾病，由创伤、烧伤等损伤真皮深层后纤维增殖紊乱所致[1,2]。相关数据报道，烧伤后HS发生率高达91%，手术后HS发生风险为40%～70%[3,4]。HS疼痛、瘙痒等症状极大影响日常生活，且严重者会并发局部溃烂或癌变，为患者带来极大肉体损害、精神痛苦。有相关研究成纤维细胞为HS患者瘢痕形成的重要效应细胞，A型肉毒毒素(Botulinum toxin A，BTXA)可抑制、治疗瘢痕增生[5]。进一步探讨BTXA的作用机制，观察BTXA对成纤维细胞内相关蛋白表达和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信号变化的影响，分析BTXA对HS成纤维细胞增殖、凋亡的机制，可为HS患者的临床生物学治疗提供理论依据和实践基础。基于此，本研究选取人成纤维细胞，探讨BTXA对HS成纤维细胞的抑制作用和分子机制。报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本研究经我院医学伦理委员会审批通过，选取2021年10月我院HS患者手术标本，经病理组织学确诊为HS；存在瘢痕凸出皮肤表面，痒、红、痛等症状，处于增生活跃期；患者知情本研究并签署知情承诺书。排除标准：取材前应用过青霉胺、类固醇激素等相关药物；取材前有放射线治疗史者；取材前有激光治疗史者；合并感染性疾病者。
1.2 材料与方法
1.2.1 HS成纤维细胞制备
将手术过程中获得的组织标本置于无菌操作台，使用手术剪去除皮下组织，保留带表皮的瘢痕组织，将瘢痕组织剪成规格为1mm×1mm小组织块，使用磷酸盐缓冲液冲洗干净，加入3倍体积1mg/ml的Ⅰ型胶原酶，37℃条件下振荡水浴40-60min，加入3倍体积完全培养基(10%胎牛血清DMEM培养基)终止消化，1500r/min，离心5min后弃上清，用完全培养基重悬细胞，80um无菌滤网过滤，将无菌滤液加入培养瓶中放37℃，5%CO2培养箱内，4d后换液，后每间隔3d换液1次，约15d细胞基本融合，依据1：3比例传代，培养3代后进行试验。
1.2.2 CCK8实验检测细胞增殖活力
分别取对数生长期细胞，调整细胞浓度为5×104/ml，接种至96孔版，100ul/孔，细胞贴壁后，分别加入浓度为0、1、2U、4U/ml BTXA，100ul/孔每组设3个复孔，细胞铺板后2h，每孔加10μL CCK8试剂，3小时后酶标仪450nm处测定各组光密度(OD)值。每隔24小时按以上方法测一次OD值，绘制细胞增殖曲线。
1.2.3 细胞划痕实验检测细胞迁移能力
取对数生长期细胞，调整密度为0.5×106/ml个，种植于6孔板中，每孔2ml。待细胞贴壁后，去除培养基，分别加入浓度为0、1、2U、4U/ml BTXA的完全培养基，2ml/孔，细胞贴壁后用消毒 1000μL移液枪头均匀划1条线，用 PBS洗细胞2次，去除漂浮细胞，显微镜下拍照记为0h，放于37℃，5% CO2培养箱培养，取24h，48h时间点于倒置显微镜下拍照，计算细胞迁移率。
1.2.4 细胞凋亡检测
取对数生长期细胞，调整细胞浓度为2×105/ml，1ml/孔，接种至24孔版，培养24h后去除培养基，分别加入浓度为0、1、2、4U/ml BTXA的完全培养基，培养48h，参照活细胞Caspase-3活性与Annexin V细胞凋亡检测试剂盒进行检测操作，染色、固定，于显微镜下观察。
1.2.5 荧光定量PCR检测成纤维相关蛋白基因变化
按照1.2.3方法进行药物干预48小时后，消化细胞，使用Trizol(碧云天)从成纤维细胞中提取总RNA，测总RNA浓度。使用天根FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂逆转录cDNA(KR118)，使用天根SuperReal PreMix Plus (SYBR Green，FP205)试剂，使用ABI StepOnePlus Real-Time PCR进行荧光定量PCR。引物合成自生工生物公司。引物序列：(1) CTGF：F:CTTGCGAAGCT GACCTGGAA,R:AAAGCTCAAACTTGATAGGCTTGGA(2)TGF1:F:GTACCTGAACCCGTGTTGCT,R:GAACCCGTTGATGTCCACTT (3)α-SMA:F:CTGCTGAGCGTGAGATTGTC,R:CTCAAGGGAG GATGAG GATG (4)JNK:F:GCTGGAATTATTCATCGGGAC、R:GATGA CCTCGGGTGCTCTG,(5)GAPDH:F:TGACTTCAACAGCGACACCCA-3 R:GGAGGAGT GGGTGTCGC TGT
1.2.6 运用Western blot法检测BTXA干预前后HS成纤维细胞中CTGF、α-SMA、TGF-β1、JNK的蛋白表达
在HS成纤维细胞中加入JNK选择性抑制剂SP600125，运用Western blot法检测BTXA干预前后p-JNK的蛋白水平。简要如下HS成纤维细胞，按照1.2.3描述的方法处理后，收取细胞后使用含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF的 RIPA高效细胞/组织裂解液(索莱宝)提取蛋白，并根据 BCA 蛋白检测试剂盒的说明书测定蛋白浓度。待测蛋白用10%的SDS-PAGE凝胶电泳(60～80V)，然后将目的蛋白在300mA 、90min的条件下转移至PVDF膜(PVDF，Millipore)。TBST溶液洗膜5min×3次；5%脱脂牛奶室温封闭1h；一抗(1∶1 000稀释)、 GAPDH(1∶1 000稀释)4℃孵育过夜后再用兔二抗(1∶1000稀释)室温孵育1 h。使用 BeyoECL plus 发光液(碧云天)发光并拍摄。
1.3 观察指标
①BTXA对HS成纤维细胞增殖能力的影响，对比无BTXA干预和1、2、4U/ml BTXA干预后成纤维细胞增殖活力变化。③BTXA对HS成纤维细胞凋亡率的影响，对比无BTXA干预和1、2、4U/mlU/ml BTXA干预后成纤维细胞凋亡率。④成纤维细胞相关蛋白表达，对比BTXA干预前后TGF-β1CTGF、α-SMA、JNK表达。⑤JNK信号通路，对比JNK选择性抑制SP600125干预前后磷酸化氨基末端激酶(p-JNK)表达。
1.4 统计学方法
采用统计学软件spss 22.0对数据进行统计分析，计量资料正态分布以()表示，组间比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 BTXA对HS成纤维细胞活力的影响
CCK8实验结果显示，与无BTXA干预相比，1、2 、4U/ml BTXA干预后48h，72h HS成纤维细胞增殖能力显著降低(P<0.05)。见图1。
图1 BTXA对HS成纤维细胞增殖的影响
2.2 BTXA对HS成纤维细胞迁移的影响
细胞划痕实验结果显示与无BTXA干预相比，2U/ml、4U/ml BTXA干预后成纤维细胞迁移能力降低，划痕愈合减慢（P<0.05）。见图2。
图2 BTXA对HS成纤维细胞迁移的影响（×100)
2.3 BTXA对HS成纤维细胞凋亡率的影响
与无BTXA干预相比，2U/ml，4U/ml BTXA干预后HS成纤维细胞凋亡率增高(P<0.05)，红色、绿色表示凋亡细胞，见图3。
图3 BTXA对HS成纤维细胞凋亡率的影响（×50)
2.4 成纤维细胞相关蛋白基因表达
荧光定量PCR结果表明，与BTXA干预前相比，BTXA干预后TGF-β1、α-SMA、CTGF基因表达均较低(P<0.05)。见图4。
图4 成纤维细胞相关蛋白基因表达
2.5 成纤维细胞相关蛋白表达
与BTXA干预前相比，BTXA干预后TGF-β1表达较低(P<0.05)。见图5
图5 成纤维细胞相关蛋白表达
2.6 JNK信号通路
与JNK选择性抑制SP600125干预前相比，JNK选择性抑制SP600125干预后p-JNK表达较高(P<0.05)。见表1。
表1 JNK信号通路
3 讨 论
HS为病理性瘢痕，在创伤6个月时增长速度，可发生在全身各个部位，HS组织学多表现为丰富纤维细胞、酸性粘多糖和排列规则Ⅲ型胶原，基底部多局限于原始损伤界限内，痛痒感明显[6,7]。目前，临床针对HS发生机制尚未做出全部阐述，但既往有研究报道HS发生与基因调控、细胞转导通路、信号因子等相关，多因素共同作用调节成纤维细胞增殖、转化、代谢、凋亡[8,9]。
成纤维细胞无法进入正常程序性死亡，会致使其异常增殖且细胞外基质过度沉积，在创伤修复晚期，依靠细胞凋亡组织改建，可改善凋亡机制，抑制HS形成。肉毒素为肉毒杆菌增殖过程中产生的细菌外毒素，依照肉毒素抗原性不同，可分为A、B、C1、C2、D、E、F、G八个类型，A型毒力最强[10,11,12]。BTXA为二硫键结合的重链和轻链组成的多肽链，能被蛋白酶裂解，可阻断神经肌肉传导，抑制神经传递介质，能抑制胶原分泌，延缓成纤维细胞增殖，诱导细胞凋亡[13,14,15]。研究结果表明，与无BTXA干预相比，1、2、4U/ml BTXA干预后HS成纤维细胞增殖能力较低、HS成纤维细胞凋亡率增高(P<0.05)。近年来，临床关于BTXA治疗HS的研究主要集中在TGF-β1上，TGF-β1为HS发生、进展过程中重要促纤维化细胞因子，其高表达可激活细胞内信号，调控JNK信号通路，将细胞外刺激信号传导至细胞内，激活相关细胞生物学反应，参与瘢痕增生[16,17]。α-SMA是肌成纤维细胞特征性标志物，是瘢痕组织具有收缩活性的结构基础，可反映成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化受影响情况。CTGF是一种分子量为36～38kDa的多肽，在成纤维细胞中主要由TGF-β诱导产生，CTGF过度激活是纤维化疾病发生和HS发生进展的重要影响因素。与BTXA干预前相比，BTXA干预后TGF-β1、α-SMA、CTGF等基因水平和蛋白水平均降低(P<0.05)，表明BTXA可调控JNK信号转导通路，抑制成纤维细胞相关蛋白基因和蛋白表达。此外，研究结果还显示，与JNK选择性抑制SP600125干预前相比，JNK选择性抑制SP600125干预后p-JNK表达较高(P<0.05)。JNK属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)亚族，BTXA可依靠MAPK途径调控细胞外基质增生，抑制信号传导和MAPK介导的细胞系列反应，阻碍细胞生物学功能，抑制HS形成。同时BTXA能调控细胞内不同蛋白比值，调整细胞增殖基因表达，影响相关DNA合成，发挥抑制瘢痕形成作用。
综上所述，BTXA可影响HS患者成纤维细胞增殖、迁移和凋亡，并能通过JNK信号通路诱导成纤维细胞凋亡，调控其相关蛋白表达，为临床治疗提供新靶点。本研究只初步探讨了BTXA对HS患者JNK信号通路和成纤维细胞相关蛋白表达的影响，但瘢痕形成主要有炎症期、纤维增生期、组织重建期，不同时期成纤维细胞活跃度存在差异，关于BTXA对不同时期HS形成的影响，有待日后进一步深入研究。