摘 要：目的：探讨遵义地区慢性乙型病毒性肝炎患者在核苷类似物治疗干预过程中乙型肝炎病毒(HBV)多聚酶区(P)基因的突变类型及发生率。方法：选取2018年12月-2019年12月在贵州航天医院就诊的102例慢性乙型病毒性肝炎患者为研究对象，分析患者在核苷类似物治疗干预后HBV多聚酶区基因的突变类型、突变位点等情况。结果：102例慢性乙型病毒性肝炎患者HBV多聚酶区基因突变类型共19种，其中以单纯rtM204I突变最多(38.24%)；核苷类似物耐药率以拉米夫定最高(59.80%)。结论：慢性乙型病毒性肝炎患者HBV多聚酶区基因突变种类较多，且核苷类似物耐药率较高，检测患者HBV多聚酶区基因突变情况有助于指导临床治疗。
关键词：核苷类似物; 慢性Z型病毒性肝炎; HBV多聚酶区; 基因突变;
慢性乙型病毒性肝炎简称乙肝，是由于乙型肝炎病毒(HBV)感染而致，临床主要表现为全身乏力、恶心、呕吐、厌食等症状。一旦确诊需积极进行治疗，如抗病毒、抗纤维化、保肝治疗等[1]。目前，临床多采用核苷类似物治疗慢性乙型病毒性肝炎患者，然而由于核苷类似物种类较多，应用广泛，导致慢性乙型病毒性肝炎患者HBV耐药性越来越强，严重影响患者的临床疗效。基于此，本研究通过了解遵义市核苷类似物干预下慢性乙型病毒性肝炎患者HBV多聚酶区基因突变类型及发生率，以及不同核苷类似物耐药率、突变位点等情况，旨在为患者的临床治疗提供更多的参考，提高患者疗效，现报告如下。
资料与方法
选取2018年12月-2019年12月在贵州航天医院就诊的102例慢性乙型病毒性肝炎患者为研究对象，包括男56例，女46例；年龄25～76岁，平均(45.87±5.42)岁。
纳入标准：(1)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》中的诊断标准；(2)核苷酸类似物治疗>6个月；(3)血清HBV DNA出现病毒学突破(HBV DNA较最低值升高>2 log10copies/mL);(3)知悉本次研究并自愿参与，签署知情同意书。
排除标准：(1)非慢性乙型病毒性肝炎者；(2)合并其他肿瘤疾病、免疫性疾病者；(3)临床资料缺失者；(4)不同意参与该研究者。
方法：(1)血清HBV DNA提取：采用北京生物科技有限公司生产的核酸提取试剂提取患者血清HBV DNA 100μL，在血清中加入100μL核酸提取液A，混匀10 s，离心10 min，离心转速12 000 r/min，之后将血清上清液抽干后加入25μL核酸提取液B，混匀10 s，置入100℃环境下保温10 min，最后离心10 min，离心转速12 000 r/min，并将上清液作为模板。(2)HBV多聚酶区(P)基因突变检测：采用序列特异性PCR技术检测患者HBV多聚酶区(P)基因突变情况。根据HBV P区基因的保守序列，采用Primer Premier5.0软件包设计引物序列，引物由武汉金开瑞生物技术公司合成，序列：a.外侧正向引物ESP:5'-AGG CCT TAT AAG TTG GCG A-3'，反向引物EAP:5'-TCC TGC TCA AGG AAC CTC TA-3';b.内侧正向引物ISP:5'-CY(T/C)T GTA TTC CCA TCC CAT C-3';c.反向引物IAP:5'-TGA CAT ACT TTC CAA TCA ATA GG-3'。目的片段共370 bp，涵盖了目前已知的主要HBV核苷类抗病毒药物耐药突变位点。结果判断：血清HBV DNA<500 copies/mL为阴性。PCR反应体系配置：第1轮PCR序列扩增：10×扩增缓冲液2.5μL，模板DNA 2μg,Taq DNA聚合酶1 U,MgCl21.5μmol/L,dNTP 2μL,ESP、EAP各1μmol/L等；第2轮PCR序列扩增：10×扩增缓冲液5μL，模板DNA 2μg,Taq DNA聚合酶2 U,MgCl23μmol/L,dNTP 2μL,ESP、EAP各1μmol/L、第1轮产物1μL等[2,3]。血清HBV基因型、P区基因的序列及编码氨基酸的分析：以NCBI基因分型中23株基因型为A-H型的HBV全基因组标准序列为参照来确定基因型；采用BIOEDIT软件包(版本7.0.9)进行核酸和氨基酸序列的比对，分析氨基酸的变异，用于比对的参考序列包括A型(M57663和X02763)、B型(D00331和D00329)、C型(AY12304l和X75656)及D型(X02496和X97848)。
观察指标：观察102例慢性乙型病毒性肝炎患者HBV多聚酶区基因突变类型及发生率。观察102例慢性乙型病毒性肝炎患者核苷类似物耐药率及其突变位点，主要核苷类似物包括拉米夫定、阿得福韦酯、恩替卡韦、替比夫定等。
结果
102例慢性乙型病毒性肝炎患者HBV多聚酶区基因突变类型及发生率：经检测，102例慢性乙型病毒性肝炎患者HBV多聚酶区基因突变类型主要有单纯变异、联合变异、混合变异。共发生19种基因突变类型，其中以单纯rtM204 I突变最多(38.24%)，其次为rtM204V/rtL180M联合变异(27.45%)。见表1。
表1 102例慢性乙型病毒性肝炎患者HBV多聚酶区基因突变类型及发生率
102例慢性乙型病毒性肝炎患者核苷类似物耐药率及其突变位点：102例慢性乙型病毒性肝炎患者中，拉米夫定耐药率为59.80%(61/102)，突变位点主要为rtM204V、rtM204I、rtL180M等；阿得福韦酯耐药率为42.16%(43/102)，突变类型为单独rtA181S、rtA181T及联合rtN236T等；恩替卡韦耐药率为22.55%(23/102)，突变类型为rtA181V/rtQ215H、rtM204V/rtL180M+rtA181T+rtN236T等；替比夫定耐药率为18.63%(19/102)，突变类型为单独rtM204I。见表2。
表2 102例慢性乙型病毒性肝炎患者核苷类似物耐药率及其突变类型
讨论
临床多采用核苷类似物治疗慢性乙型病毒性肝炎，常见药物如拉米夫定、阿得福韦酯、恩替卡韦、替比夫定等，此类药物具有服用简便、不良反应低、病毒复制抑制能力强等特点，因而在治疗慢性乙型病毒性肝炎中应用广泛，且这些药物在慢性乙型病毒性肝炎中的疗效得到了肯定[4]。然而，随着核苷类似物长期使用，其可诱导患者的HBV基因发生突变，耐药性也随之增强，影响了患者临床疗效。
目前，所有口服核苷类似物(包括拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定)在慢性乙型病毒性肝炎治疗过程中均可出现耐药性。细胞试验发现，拉米夫定耐药的病毒株对恩替卡韦显型敏感性降低8～30倍。如果乙肝病毒多聚酶本来就存在对拉米夫定耐药的氨基酸置换(rtL180M和/或rtLM204V/I)，再加上rtT184、rtS202或rtM250位点的置换变异，都会造成对恩替卡韦的显型敏感性降低更多(>70倍)。然而，对耐药相关的一些问题国内外均没有共识。有专家认为，肝脏基础好的慢性乙型病毒性肝炎患者如果抗病毒耐药后，最好在出现临床耐药的时候换药，因为此时患者出现病毒反跳，酶学增高，此时换药有利于免疫清除病毒；而对于肝硬化，尤其是失代偿期肝硬化或肝移植患者最好在基因型耐药时换药，以免肝功能失代偿。因此，对于慢性乙型病毒性肝炎患者，在出现耐药后应及时换药或联合治疗，避免加重患者病情。
本研究通过检测发现，慢性乙型病毒性肝炎患者HBV多聚酶区基因突变类型达19种之多，其中以单纯rtM204I突变最多(38.24%)，其次为rtM204V/rtL180M联合变异(27.45%)；且在核苷类似物耐药率及其突变位点检测中发现，拉米夫定(59.80%)具有极高的耐药性，突变位点也较多，其次为阿得福韦酯(42.16%)、恩替卡韦(22.55%)和替比夫定(18.63%)。有研究表明，拉米夫定在治疗慢性乙型病毒性肝炎中，药物使用时间越长，HBV多聚酶区基因突变发生率越高[5]。因此，根据本次研究，在治疗慢性乙型病毒性肝炎患者时，通过检测患者HBV多聚酶区基因突变情况，选择合适的药物进行治疗，更有利于提高患者的临床疗效。
[1]赵建强,刘加法.山东省潍坊市慢性乙型肝炎患者HBV P区基因耐药突变检测及相关因素分析[J] .病毒学报,2015,31(1):14-17.
[2]文晓飞，马庆庆,熊玮,等遵义地区慢性乙型病毒性肝炎少数民族患者检测基因分型与耐药变异的相关性和意义[J].临床检验杂志(电子版),.2017,6(2):200-201.
[3]樊正勤,曹灵芝,赵耘,等核苷类似物干预后慢性乙型肝炎患者HBV多聚酶区基因突变模式与危险因素分析[J].实用临床医药杂志,2017,21(5):54-56.
[4]吴艳丽，邹尚平，王雪英广东梅州地区850例慢性乙型病毒性肝炎血清HBV基因分型和耐药突变概况[J] .赣南医学院学报,2015,35(4):553-555.
[5]胡爱荣,蒋素文，丁世雄等核苷和核苷酸类药物在慢性乙型肝炎病毒感染者中的应用及耐药突变分析[C].第:二十四次全国中西医结合肝病学术会议论文汇编,2015.