摘 要：目的 研究熊果苷通过调控巨噬细胞Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)通路抑制结核分枝杆菌活性的机制。方法 将小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7分为对照组和熊果苷组，对照组正常培养，不干预;熊果苷组给予100μg/m L熊果苷干预24 h后，再用1 000 ng/m L脂多糖培养24 h。通过定量聚合酶链式反应(PCR)法和蛋白质印迹法检测两组细胞TLR4和NF-κB表达的影响，并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测熊果苷对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6的影响。40只昆明雄性小鼠经尾静脉注射H37Rv结核分枝杆菌毒株建立结核菌感染小鼠模型，随机将其均分为4组:不进行任何治疗的结核组，低剂量组、中剂量组和高剂量组分别接受腹腔注射10、25和50 mg/kg熊果苷治疗1次/周，共4周。结核感染模型建立4周后，处死小鼠，收集心脏外周血和肺组织，抗酸染色检测肺组织结核分枝杆菌数目; ELISA法检测小鼠外周血TNF-α、IL-1β和IL-6含量;流式细胞仪检测小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率和外周血CD68阳性细胞TLR4/NF-κB表达。结果 与对照组相比，熊果苷组RAW264.7细胞TLR4和NF-κB表达显著增高，培养基中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均显著升高，差异均有统计学意义(P <0.05)。与结核组小鼠相比，经不同剂量熊果苷治疗(低剂量组、中剂量组和高剂量组)的结核杆菌感染的小鼠体重、外周血巨噬细胞TLR4/NF-κB表达水平以及外周血TNF-α、IL-1β和IL-6含量均显著增高，肺组织结核分枝杆菌数目和肺泡巨噬细胞凋亡率均显著降低，差异均有统计学意义(P <0.05)，且以上指标均存在剂量依赖。结论 熊果苷可以通过促进巨噬细胞TLR4/NF-κB通路的激活而促进巨噬细胞的存活和炎症因子的分泌，进而发挥抗结核的功能。
关键词：熊果苷 结核分枝杆菌 巨噬细胞 TLR4/NF-κB
Arbutin inhibits the activity of Mycobacterium tuberculosis by regulating the TLR4/NF-κB pathway of macrophages
LI Wei-hong HAN Yun SHI Cheng-ling
Department of Dermatology,STD and AIDS,Fourth People's Hospital of Qinghai Province;
Abstract：Objective To study the mechanism of arbutin inhibiting the activity of Mycobacterium tuberculosis by regulating the Toll-like receptor 4( TLR4)/nuclear factor kappa-B( NF-κB) pathway of macrophages. Methods Mouse mononuclear macrophage leukemia cells RAW264. 7 were divided into control group and arbutin group. The control group was cultured normally without intervention; the arbutin group was treated with 100 μg/m L arbutin for 24 h,and then cultured with 1 000 ng/m L lipopolysaccharide for 24 h. The effects of TLR4 and NF-κB expression in the two groups of cells were detected by quantitative polymerase chain reaction( PCR) and Western blotting,and enzyme-linked immunosorbent( ELISA) was used to detect the effect of arbutin on the secretion of tumor necrosis factor alpha( TNF-α),interleukin( IL)-1β and IL-6 in RAW264. 7 cells induced by lipopolysaccharide( LPS). Forty Kunming male mice were injected with the H37 Rv Mycobacterium tuberculosis strain through the tail vein to establish a tuberculosis infection mouse model. They were randomly divided into 4 groups: tuberculosis group without any treatment,low-dose group,medium-dose group and the high-dose group received intraperitoneal injection of 10,25 and 50 mg/kg arbutin once. Four weeks after the tuberculosis infection model was established,the mice were sacrificed,peripheral blood of the heart and lung tissues were collected,and acid-fast staining was used to detect the number of Mycobacterium tuberculosis in lung tissues; ELISA method was used to detect the levels of TNF-α,IL-1β and IL-6 in peripheral blood of mice; Flow cytometry to detect the apoptotic rate of alveolar macrophages in mice and the expression of TLR4/NF-κB in CD68-positive cells in peripheral blood. Results Compared with the control group,the expression of TLR4 and NF-κB in RAW264. 7 cells in the arbutin group was significantly increased,and the contents of TNF-α,IL-1β and IL-6 in the medium were significantly increased,and the differences were statistically significant( P < 0. 05). Compared with mice in the tuberculosis group,the body weight,the expression level of TLR4/NF-κB in peripheral blood macrophages,and the expression levels of TLR4/NF-κB in peripheral blood macrophages of mice infected with Mycobacterium tuberculosis treated with different doses of arbutin( low-dose,medium-dose and high-dose groups),the levels of TNF-α,IL-1β and IL-6 in peripheral blood were significantly increased,and the number of Mycobacterium tuberculosis in lung tissue and the apoptosis rate of alveolar macrophages were significantly decreased,and the differences were statistically significant( P < 0. 05). And the above indicators are all dose-dependent. Conclusion Arbutin promotes the survival of macrophages and the secretion of inflammatory factors by promoting the activation of the TLR4/NF-κB pathway of macrophages,thereby exerting anti-tuberculosis function.
Keyword：Arbutin; Mycobacterium tuberculosis; Macrophages; TLR4/NF-κB;
肺结核是由结核分枝杆菌感染肺部引起的可传染性疾病。近年来，虽然随着我国防痨手段和结核治疗技术的不断进步，结核病的发病率和病死率均有所下降，但结核病依然是造成我国居民死亡的主要传染病[1-2]。结核分枝杆菌感染人体后，主要巨噬细胞吞噬以去除，而未被人体免疫系统发现的结核分枝杆菌则主要存活在宿主巨噬细胞内[3]。因此，从巨噬细胞入手开发抗结核新型药物是当前研究热点。
熊果苷又名熊果素，是一种由杜鹃花科植物熊果叶中萃取出的成分，能够通过抑制体内酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑，同时还有杀菌、消炎的作用，主要应用于化妆品中[4-5]。Ebrahim-Tabar等[6]研究发现，熊果苷可以调控视力黄素诱导的大鼠小胶质细胞(脑和脊髓中的巨噬细胞)的激活。然而，熊果苷对结核分枝杆菌感染后小鼠巨噬细胞激活、存活和免疫功能的影响还依然未知。本研究以小鼠巨噬细胞RAW264.7和结核分枝杆菌感染的小鼠为体内外模型，研究熊果苷对巨噬细胞激活、存活和免疫功能的影响，探讨其是否可以通过调控巨噬细胞而发挥抗结核功能。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
40只昆明小鼠，雄性，6～8周龄，体重(20±2) g，购自北京维通利公司[SCXK(京) 2020-0045]。
1.1.2 试剂与仪器
小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7 (货号:SC-6003，美国典型培养物保藏中心);胎牛血清(10100-147，美国Thermo Fisher公司);DMEM培养基(12491-15，美国Thermo Fisher公司);熊果苷(A106856，上海阿拉丁生化科技股份有限公司);CD68-PE抗体(货号:130-102-923，美国Miltenyi公司);Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)-FITC抗体(北京安诺伦生物科技有限公司);核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)-APC抗体(货号:130-124-298，美国Miltenyi公司);小鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)检测试剂盒(货号:ab208348，英国abcam公司);小鼠白细胞介素(interleukin,IL)-1β检测试剂盒(ab197742，英国Abcam公司);小鼠IL-6检测试剂盒(货号:ab222503，英国Abcam公司);Nano Drop 2000超微量分光光度计(美国Thermo Fisher公司);流式细胞仪(型号:cytoflex1L5C，德国Beckman公司);荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪(型号:CFX Connect，美国伯乐bio-rad公司);酶联免疫检测仪(型号:BIOBASE-EL10C，山东博科生物产业有限公司);膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)。
1.2 细胞培养与处理
RAW264.7细胞培养在添加10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件为37℃和5%CO2。终浓度100μg/m L熊果苷加到RAW264.7细胞培养基中培养24 h，然后加入1 000 ng/m L脂多糖培养24 h，以此为熊果苷组;另设置对照组，正常培养，不进行任何干预。
1.3 结核分枝杆菌感染模型
40只昆明小鼠经尾静脉单次注射国际标准毒力的结核分枝杆菌H37Rv菌株建立结核分枝杆菌感染模型，注射剂量为1×106CFU，共注射0.3 m L/只。每组随机挑选2只小鼠，通过病理实验进行模型鉴定，观察到小鼠肺部出现较多结核结节或干酪样坏死及液化灶等典型结核病变现象即为模型建造成功。
1.4 分组
随机将感染结核分枝杆菌的40只小鼠均分为4组:结核组、低、中和高剂量组。结核组不进行任何治疗，低、中和高剂量组分别腹腔注射10、25、50 mg/kg熊果苷治疗1次/周，共4周。3组小鼠在感染结核分枝杆菌4周后，经颈椎脱臼处死。
1.5 实验方法
1.5.1 细胞中TLR4/NF-κB mRNA表达检测
RAW264.7细胞经熊果苷处理后被收集。加入适量的RNAiso以提取RNA。根据提取RNA的含量加入ddH2O溶解RNA,NanoDrop 2000超微量分光光度计测定RNA浓度，经反转录成cDNA。根据GoTaqqPCRMaster Mix试剂盒说明书制备20μL RT-qPCR系统，并使用荧光定量PCR仪器进行扩增。PCR参数设定:95℃/30 s,(90℃/5 s,65℃/30 s)-40个循环。以β-actin为内参，用2-△△t法计算目的基因的相对表达量。PCR引物如下:TLR4-F:5'-ATGGCATGGCTTA-CACCACC-3',TLR4-R:5'-GGCCGACTGATC-CAGAACTT-3';NF-κB-F:5'-TGCGATTCCGCTATA-AATGCG-3',NF-κB-R:5'-ACAAGTTCATGTGGAT-GAGGC-3';β-actin-F:5'-GCCCATCCTTCGAGTA-CAAA-3';β-actin-R:5'-TCTTGGTGCGATAACTG-GTGG-3'。
1.5.2 细胞中TLR4/NF-κB蛋白表达检测
收集经熊果苷和脂多糖处理的RAW264.7细胞，经无菌预冷的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution,PBS)洗涤3次后，分别加入TLR4-FITC抗体和NF-κB-APC抗体室温孵育半小时后，再经无菌预冷的PBS洗涤3次，最后由流式细胞仪检测荧光强度。对于小鼠外周血，收集小鼠外周血，离心(室温，1 000 g,10 min)以去除血清，加入红细胞裂解液裂解红细胞后，经无菌预冷的PBS洗涤3次后，分别加入CD68-PE和TLR4-FITC抗体，CD68-PE和NF-κB-APC抗体室温孵育半小时后，再经无菌预冷的PBS洗涤3次，最后由流式细胞仪检测荧光强度。
1.5.3 体重检测
干预4周后，对各组小鼠进行常规称重并记录。
1.5.4 ELISA法检测小鼠血清和细胞TNF-α、IL-1β和IL-6含量
称重后，颈椎脱臼处死小鼠后，通过腹主动脉取血，离心取血清保存待检;然后收集细胞，离心取上清液，经小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6酶联免疫吸附试验检测试剂盒检测TNF-α、IL-1β和IL-6含量，具体检测过程按照试剂盒说明书进行。
1.5.5 小鼠肺组织结核分枝杆菌检测
同上时间点及方法处死小鼠，快速分离小鼠肺组织，经4%多聚甲醛溶液室温固定2 h后，制作石蜡切片。通过对小鼠肺组织石蜡切片进行抗酸染色以检测结核分枝杆菌数目。
1.5.6 小鼠肺泡巨噬细胞凋亡检测
颈椎脱臼处理小鼠后，暴露小鼠支气管，插入连接注射器的无菌软皮管，固定后打入1 mL预冷的无菌PBS，共计10次。离心(4℃，2 000×g,10 min)以收集支气管肺泡灌洗液中的细胞，加入DMEM培养液重悬细胞后，加入CD86-PE抗体室温孵育半小时后以区分巨噬细胞，经无菌预冷的PBS洗涤3次，再由Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测凋亡。
1.6 统计学处理
本研究数据通过SPSS 19.0进行统计学分析，计量资料以均数±标准差形式表示。两组间数据差异比较采用非配对学生t检验;多组间差异比较单因素方差分析，事后检验两组间差异比较采用turkey检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 熊果苷对RAW264.7单核巨噬细胞TLR4/NF-κB通路表达的影响
与未进行任何处理的对照组相比，经熊果苷处理的熊果苷组RAW264.7单核巨噬细胞TLR4和NF-κB mRNA和蛋白表达水平均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 两组RAW264.7单核巨噬细胞TLR4和NF-κB表达比较
2.2 熊果苷对RAW264.7单核巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6表达的影响
与对照组相比，熊果苷组培养RAW264.7单核巨噬细胞培养液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。
表2 两组RAW264.7单核巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6表达比较
2.3 各组小鼠体重、肺组织结核分枝杆菌和巨噬细胞数目比较
与结核组小鼠相比，经不同剂量熊果苷治疗(低剂量组、中剂量组和高剂量组)的结核杆菌感染的小鼠体重均显著增高，肺组织结核分枝杆菌数目和肺泡巨噬细胞凋亡率均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，且均存在剂量依赖。见表3。
表3 各组小鼠体重、肺组织结核分枝杆菌和巨噬细胞数目比较
2.4 各组小鼠外周血单核巨噬细胞TLR4/NF-κB通路表达比较
与结核组小鼠相比，经不同剂量熊果苷治疗(低剂量组、中剂量组和高剂量组)的结核杆菌感染的小鼠外周血单核巨噬细胞TLR4和NF-κB表达的荧光强度均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，且均存在剂量依赖。见表4。
表4 各组小鼠外周血单核巨噬细胞TLR4和NF-κB表达比较
2.5 各组小鼠外周血TNF-α、IL-1β和IL-6比较
与结核组小鼠相比，经不同剂量熊果苷治疗(低剂量组、中剂量组和高剂量组)的结核杆菌感染的小鼠外周血TNF-α、IL-1β和IL-6含量均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，且均存在剂量依赖。见表5。
表5 各组小鼠外周血TNF-α、IL-1β和IL-6含量比较
3 讨论
结核分枝杆菌即结核杆菌是引起传染性疾病，结核病的病原菌体，是威胁世界公共卫生安全传染性致病菌。据世界卫生组织统计数据显示，在全球范围内每年新发结核病患者超过100万，死亡约180万左右[1]。在中国，结核病的发病率是58/10万，虽然结核病疾病负担在世界发病率较高的30个国家中仅排第28位，但由于我国人口基数较大，所以依然存在较大数量的结核病人群[2]。因此，研究结核杆菌感染后病理机制意义重大。
在体外，本研究首先发现，熊果苷可以显著促进单核巨噬细胞中TLR4和NF-κB表达水平，并促进单核巨噬细胞炎症因子的分泌水平。巨噬细胞是抑制结核分枝杆菌入侵的第一道防线，也是人体对入侵的结核菌清除的主要效应细胞[7]。巨噬细胞被入侵的结核菌激活后，会通过细胞膜内陷和出芽的方式吞噬结核菌，最终将其消灭[8]。TLR4是巨噬细胞表面感知并将病源体入侵信号传递到细胞内的主要蛋白，而NF-κB是与TLR4相互连接的蛋白分子。当巨噬细胞表面的TLR4受体感知到入侵机体的结核菌后，就会将信号通过给NF-κB，再由NF-κB转入细胞核而调节相关蛋白的表达(包括前炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6)，最终消灭入侵的结核菌[9-10]。综上可表明，熊果苷在体外实验中促进巨噬细胞的激活。
此外，本文还进行了体内研究。本研究通过尾静脉注射H37Rv菌株建立结核杆菌感染小鼠模型。H37Rv是结核分枝杆菌国际标准毒力的毒株，是被用于制备结核感染动物模型的常用工具菌。但需要指出的是，本次研究选择通过尾静脉注射这一血源性感染结核杆菌的方式，虽然与结核杆菌实际感染方式不同，但需要指出的是血源性感染在达到呼吸道感染相同效果的同时，具有感染剂量易控的优势[11]。本研究发现，经熊果苷治疗的结核菌感染小鼠不仅体重显著高于未治疗的对照组小鼠，而且肺组织内的结核菌数目和肺泡中巨噬细胞的凋亡比率均显著降低。这表明熊果苷在小鼠模型中有显著的抗结核效果，与赵丰权等[12]的研究结果类似。赵丰权等[12]研究发现，黄芩苷腹腔注射治疗显著降低结核菌感染小鼠模型肺组织结核菌数目，表明黄芩苷具有抗结核功效。
人体感染结核菌后不一定发病，当抵抗力降低或细胞介导的变态反应增高时，才可能引起临床发病，因此，免疫力低下是结核菌感染和感染后疾病进展的主要原因[13-14]。而目前抗结核药物的使用又会进一步降低患者免疫力，这也是导致抗结核治疗失败的主要原因之一[15]。因此，开发增强免疫力的抗结核药物意义重大。本研究发现，经熊果苷治疗的结核菌感染小鼠外周血单核巨噬细胞TLR4/NF-κB表达，以及外周血TNF-α、IL-1β和IL-6含量均显著高于未治疗的对照组小鼠，这表明熊果苷可以通过促进巨噬细胞表面NF-κB和TLR4的表达，增加巨噬细胞的免疫功能和对结核的杀伤作用，削弱结核分枝杆菌的逃避机制。
4 结论
综上所述，熊果苷在结核菌感染的小鼠模型中具有抗结核功效，其机制可能与通过调控巨噬细胞TLR4/NF-κB增强巨噬细胞免疫活性和促进巨噬细胞存活有关。但需要指出的是依然存在一些不足:第一，未使用NF-κB抑制剂以研究熊果苷对TLR4/NF-κB的调控是否为靶向作用;第二，未详细研究熊果苷治疗结核菌感染小鼠的量效关系。
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