高 玲1 郑 辉2
1.长春医学高等专科学校，吉林长春 130000；2.吉林大学中日联谊医院，吉林吉林 132000
[摘要] 目的 研究TNFα可否通过神经钙调蛋白导致皮层神经细胞损伤。 方法 选取2014年3—2014年8月该研究医室的实验大鼠48例为研究对象，通过对原代培养大鼠脑皮层神经细胞毒性的研究可以发现，MTT法和LDH释放率测定显示大剂量的促炎性细胞因子TNFα对皮质神经元具有损伤作用，CsA可明显降低TNFα引起的LDH释放率的增加。 结果 神经钙调蛋白途径在TNFα引起皮质神经元损伤并不起主要作用，同时TNFα可通过非神经钙调蛋白途径引起神经元损伤。 结论 通过对原代培养大鼠脑皮层神经细胞毒性的研究可以发现，MTT法和LDH释放率测定显示大剂量的促炎性细胞因子TNFα对皮质神经元具有损伤作用，CsA可明显降低TNFα引起的LDH释放率的增加，而TNFα单独作用不能明显降低LDH的释放率（P>0.05），差异无统计学意义。
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关键词 TNFα；神经钙调蛋白；介导；皮层神经元；MTT法
[中图分类号] R [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１4）12（c）－０102-02
神经钙调蛋白(calcineurin，CN)有时也被称作钙调神经磷酸酶，是丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酶家族中的一类，也是现阶段所知的唯一一类活性受Ca2 ／CaM调节的蛋白磷酸酶。CN是由催化亚单位CnA和调节亚单位CnB组成的异二聚体。当胞浆内钙增高时，可激活CN，发挥蛋白脱磷酸化作用。众所周知，炎性细胞因子IL-1β和TNFa等参与多种神经疾病(如中风、神经变性病等)的神经元损伤发病机制[1]。前期研究发现：CN介导了IL-1β引起的皮层神经元损伤[2]。同为重要的细胞因子TNFα是否也是通过类似的机制引起皮层神经细胞损伤的，目前还一直未知。因此，该研究选取2014年3—2014年8月该研究医室的实验大鼠48例为研究对象，拟观察TNFα对原代培养大鼠脑皮层神经细胞毒性，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 试剂和药品
凋亡检测试剂盒、乳酸脱氢酶试剂盒、胎牛血清及马血清、多聚赖氨酸、环孢菌素A(CsA)、Annexin V —FITC和碘化丙啶(propidium iodide，PI)、TNFα、DMEM。
1.2 方法
1.2．1 原代大鼠脑皮质神经细胞培养 对Matsushita［3］等人的研究方法稍作改变，即取孕17~19 d的SD大鼠（北京大学医学部动物部）胎鼠，在无菌条件下将大脑皮层取出，去除软脑膜和血管，再将其剪碎为0.5 mm3左右，采用D-Hank’s液清洗2次，再放置在0.25%的胰蛋白酶中进行消化，使温度维持在37 ℃进行孵育15 min左右，加入10%的胎牛血清，终止处理胰酶消化，离心后取上清。另外，加入10%的胎牛血清和5%的马血清两种接种培养液，用吸管进行吹打，把细胞分散开，从而形成单细胞悬液，用尼龙网过滤悬液并计数，使细胞的浓度为1×106 cells/mL，并在具有多聚赖氨酸的培养板上进行接种，等待48 h后给予全量换液处理，72 h后把10 μg/mL的阿糖胞苷加入到培养液，促进抑制非神经元增生。再等待24 h后进行半量换液。以后3 d/次的进行半量换液，培养7～10 d后的神经细胞可以用于实验。
1.2．2 神经细胞损伤实验 采用已经培养好的神经细胞，将8孔分为1组，TNFα实验共分6组，TNFα浓度分别为0 ng／mL、0．01 ng／mL、0．1 ng／mL、1 ng／mL、10 ng／mL和100 ng／mL；作量效关系曲线图，并取适当浓度的神经细胞进行后续实验。
1.2．3 测定细胞生存力 采用MTT比色法对细胞生存力进行检测，具体方法如下：当细胞培养至所需天数时，通过TNFα等处理后的细胞，把20 μL(5 mg/mL)的MTT液加入到每个孔中，孵箱温度维持在37 ℃左右，孵育4 h后取出，把培养液取出，另外加入150 μL的DMSO到每个孔中，通过微量混匀器将液体混合均匀，采用酶标仪570 nm读取吸光度(A)值。
1.2．4 测定乳酸脱氢酶(LDH)释放率 采用乳酸脱氢酶试剂盒进行LDH释放率的测定。阅读说明书之后仔细进行操作，细胞的受损程度可以通过LDH释放情况显示，将每组8孔的培养细胞分为实验组和对照组。
1.2．5 采用免疫荧光分析细胞的坏死和凋亡 采用AnnexinV免疫荧光仔细观察细胞的凋亡情况，凋亡的细胞呈现绿色，用PI免疫荧光观察细胞的坏死情况，坏死的细胞呈现红色。Annexin V免疫荧光可以在细胞凋亡过程中对翻转至膜外的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，I S)进行高亲和力的特异性结合。荧光探针为标记有FITC的AnnexinV，通过荧光显微镜仔细检测发生凋亡的细胞数目。作为一种核酸染料的PI，其本身可以透过凋亡晚期或已死亡的细胞的细胞膜，把细胞核染成红色。
1.3 统计方法
把所得数据通过spss18.0软件进行分析，用(x±s)表示计量资料，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验。
2 结果
2.1 TNFα对于培养大鼠脑皮质神经元生长的影响
通过MTT法筛选出细胞因子TNFα对皮质神经元的量效关系和时效关系。从图1a中可以看出，随TNFα剂量的增加，皮质神经元吸光度值下降，呈现明显的量效关系。浓度为0.1 ng/mL时，皮质神经元的吸光度值与正常对照组比较有明显的下降（P<0.05）。因此选用此剂量的TNFα作用于皮质神经元，观察其作用皮质神经元不同点的吸光度值变化用以反应细胞的生存力变化。从图1b中可见 ，TNFα（0.1 ng/mL）作用于皮质神经细胞后，随作用时间的延长，皮质神经元的吸光度值开始下降，在30 min之后，皮质神经元的吸光度值与未处理时的吸光度值比较开始明显下降（P<0.05），呈现明显的时效关系。
2.2 神经钙调蛋白对TNFα引起神经细胞损伤的影响
如图2a的MTT法中可以看出，TNFα与正常对照组比较，可明显引起皮层神经元的损伤（P<0.05）。而TNFα与CsA联合应用组，皮层神经元的生存力提高不明显，差异无统计学意义。在图2b的LDH释放率测定实验中可见，CsA可明显降低TNFα引起的LDH释放率的增加。TNFα和CsA联合作用组，与TNFα单独作用组一样，不能明显降低LDH的释放率（P>0.05）。
2.3 TNFα诱导神经细胞损伤性质及程度研究
利用PI和Annexin V 染色标记早期凋亡及坏死的细胞数目，从形态学的角度进一步证明神经钙调蛋白对细胞因子引起的损伤作用的影响。
从图3 TNFα(0.1 ng/mL)处理后, 细胞的凋亡和坏死率明显增加。CsA与TNFα联合应用组细胞,凋亡和坏死率与单纯损伤组比较无明显降低（P>0.05）
3 讨论
细胞因子的神经毒性和神经保护作用与促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的平衡密切相关。在神经系统病变过程中，促炎性细胞因子变化较早，往往在神经元发生明显损伤(坏死)前即发生显著变化。在神经退行性病变过程中，脑内的促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的产生均增加。如脑AD[1] 缺血[4]。这些炎症因子反应可能是去除致病因素的起始者和抑制神经退行性变过程。然而，一个失控的炎症反应可以促进这个过程。促炎性细胞因子如IL-1β或TNFα具有神经毒性的研究资料很多，但详细机制尚未阐明[3]。大量研究资料表明，IL-1β、TNFα对正常神经元和健康组织没有毒性作用，但在创伤，缺血，炎症性脑损伤时即使处于非常低的浓度也能加重上述损伤[5]。
CN在脑组织中的含量最为丰富，尤其是在脑皮层，海马，纹状体中[6]。CN在脑内有多种作用如淀粉β肽形成、凋亡、DARPP-32的去磷酸化、NOS的去磷酸化、基因调节、激素控制、缺血、长时程增强、记忆、突起形成、离子通道的调节等。同时也发现CN的激活对生长有负性调节作用。环孢素A(cyclosporine A,CsA)是强效的免疫抑制剂，多应用于器官移植。在淋巴细胞中CsA通过影响T细胞增殖的有关的钙依赖的信号转导而防止淋巴因子基因的激活[7]。它同时也是CN的特异性抑制剂。
该实验利用促炎性细胞因子TNFα损伤原代培养的皮质神经元，复制神经退变的细胞模型。根据TNFα的量效与时效作用曲线，在皮层神经元中分别采用 TNFα（0.1 ng/mL）的剂量损伤皮质神经元[8]。通过MTT法和LDH释放率测定实验，可以看出，大剂量的促炎性细胞因子TNFα对皮质神经元具有损伤作用，CsA可明显降低TNFα引起的LDH释放率的增加。TNFα和CsA联合作用组，与TNFα单独作用组不能可明显降低LDH的释放率（P>0.05）。此现象在免疫荧光实验结果中进一步得到证实，CsA与TNFα联合应用组细胞，凋亡和坏死率与单纯损伤组比较无明显降低（P>0.05）。因此，通过该实验，我们首次发现，神经钙调蛋白途径在TNFα引起皮质神经元损伤并不起主要作用。说明TNFα可通过非神经钙调蛋白途径引起神经元损伤。
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参考文献
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[2] 高玲，康劲松，候忠赤，等.神经钙调蛋白介导IL-1β诱导的NF-kBp65的表达及神经毒性[J].中国病理生理杂志，2005，21（4）：625-629.
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[7] 季恩飞，刘学文.p38MAPK信号通路抑制剂对NMDA诱导的体外培养的皮层神经元损伤的保护作用及机制[J]. 山东大学学报：医学版，2013,51（11）：10-15.
[8] 高玲，贺伟，曹延平，等.神经钙调蛋白介导IL-1β引起的皮层神经元损伤 [J].中外医疗，2013,32（36）：32-33.
（收稿日期：2014-10-27）