杨 静1 张建军2 钟 森3
1.雅安市人民医院感染科，四川雅安 625000；2.泸州医学院附属医院感染科，四川泸州 646000；
3.成都中医药大学附属医院肝病科，四川成都 610072
[摘要] 目的 研究中药雄黄主要成分As2S2对人肝癌细胞株QGY-77 03增值和凋亡的影响及其可能机制。方法 2012年9月—2013年4月，分析不同浓度的As2S2处理QGY-7703细胞后，MTT法测定细胞增殖抑制率；流式细胞仪检测细胞凋亡率；免疫细胞化学方法检测PCNA的表达情况。结果 较低浓度（7.5 mg/L）的As2S2对QGY-7703细胞的生长无影响；15~120 mg/L的As2S2可抑制细胞的生长，具有时间依赖性和浓度依赖性（P<0.01）。As2S2在15~30 mg/L范围内，细胞凋亡率随浓度和作用时间增加而增加（P<0.01）；60 mg/L组凋亡率比低浓度组低，表现为继发性坏死细胞增多。As2S2处理组可明显降低PCNA蛋白的阳性表达（P<0.01）。 结论 As2S2在一定的浓度范围内可以诱导QGY-7703细胞发生凋亡，通过下调PCNA的表达抑制细胞的增殖，随着作用时间的延长和（或）浓度的提高，As2S2表现出一定的细胞毒作用，促进肿瘤细胞坏死。
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关键词 雄黄；肝细胞癌；凋亡
[中图分类号] R736 [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１5）01（b）－０012-02
雄黄的主要成分为As2S2，具有解毒杀虫、燥湿祛痰、截疟的功效[1]，常用来治疗痈肿疗疮、蛇虫咬伤、虫积腹痛、惊痫和疟疾等疾病。近年来，As2O3在白血病的治疗中疗效显著，已被广泛应用于多种恶性肿瘤的研究和临床治疗。作为毒性更小的含砷化合物，雄黄及其复方制剂在白血病治疗中也取得了可喜的成绩[2]，其抗肿瘤效应及机制的研究也越来越深入[3]。但有关雄黄对实体瘤的报道较少。自2012年9月—2013年4月，该实验以人肝癌细胞株QGY-7703细胞为研究对象，探讨雄黄的主要成分As2S2对肝癌细胞的影响及其作用机制，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
As2S2（纯度98％）购自美国Sigma公司，配制方法参照文献4，RPMI 1640袋装培养基购自美国Gibco公司，小牛血清购自杭州四季青生物公司，DMSO及MTT购自美国Amresco公司，AnnexinV-FITC 凋亡检测试剂盒购自美国Beckman公司，鼠抗人PCNA单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。人肝癌细胞株QGY-7703由泸州医学院实验室提供。
1.2 细胞培养
人肝癌细胞株QGY-7703常规复苏后用含10%新生小牛血清的RPMI 1640培养液在含5% CO2、37℃培养箱中培养。培养液中分别含有青霉素、链霉素各100 U/mL。取对数生长期的细胞进行实验。
1.3 MTT法观察As2S2对肝癌细胞株增殖的影响
将QGY-7703细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度为3.0×104 个/mL，接种于96孔培养板内（200 μL/孔），同时设实验组（不同浓度的As2S2处理）、对照组（不加药物的细胞）和空白组（调零），每组设5个复孔。次日细胞贴壁后，实验组弃去培养液加不同浓度的As2S2，培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入MTT液20 μL（5 g/L），于培养箱中继续培养4 h。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，震荡10 min，用酶联免疫检测仪于490 nm波长处测定其吸光度（A）值，按公式计算：细胞增殖抑制率＝(1－实验组A值/对照组A值)×100%。
1.4 流式细胞仪技术观察As2S2对肝癌细胞株凋亡的影响
胰蛋白酶消化细胞成单细胞悬液，以1.0×105 个/mL的密度接种于6孔培养板内（2.5 mL/孔）。次日细胞贴壁后，实验组加入含不同浓度As2S2的培养基。分别培养48 h、72 h后，弃去培养液，收集细胞。实验组分别加入Annexin V (FITC标记) 5 μL、PI 2.5 μL，避光冰上孵育10 min，进行流式细胞仪检测。
1.5 免疫细胞化学方法检测PCNA的表达
胰蛋白酶消化细胞成单细胞悬液，以4×104 个/mL的密度接种于预置玻片（经多聚赖氨酸处理）的6孔培养板内（2.5 mL/孔），置于37℃、5% CO2孵箱中培养。次日细胞贴壁后，实验组弃去培养液，每孔重新加入含不同浓度As2S2的培养基2.5 mL，使As2S2终浓度分别为15 mg/L、30 mg/L。培养48 h后，取出玻片按SABC法进行免疫细胞化学染色，按试剂盒说明书操作，PBS代替一抗作阴性对照。
1.6 统计方法
采用spss 13.0统计软件对数据进行统计分析。计量资料用均数士标准差(x±s)表示，采用单向方差分析(One-way ANOVA)，各实验组与对照组间比较用LSD法。
2 结果
2.1 As2S2对QGY-7703细胞增殖的影响
7.5 mg/L As2S2对QGY-7703细胞生长无影响（P>0.05）。15~120 mg/L的As2S2可抑制细胞的生长，且在此范围内抑制率随着浓度增加而增加，具有时间依赖性和浓度依赖性，差异有统计学意义（P<0.01）。15 mg/L As2S2处理组作用24 h抑制率是（8.01±1.93）%，72 h达（59.93±4.63）%。而120 mg/L As2S2处理组作用24 h、72 h的抑制率分别是（43.10±1.79）%、（83.56±3.49）%。As2S2的浓度、作用时间和抑制率之间的关系见图1。
2.2 流式细胞仪检测As2S2对QGY-7703细胞凋亡的影响
如表1所示，与对照组比较，实验组细胞凋亡率呈不同程度上升，与此同时，活细胞数随雄黄浓度增高而急剧下降。As2S2在15~30 mg/L范围内，细胞凋亡率随浓度增加而增加，而继发性坏死细胞比例也在增加。60 mg/L组出现细胞凋亡率较低浓度组减低，表现为继发性坏死细胞增多。
2.3 免疫细胞化学方法检测As2S2对QGY-7703细胞PCNA表达的影响
PCNA蛋白阳性表达均定位于细胞核。凡细胞核内见有均匀一致分布的棕黄色颗粒，胞浆不着色者即为阳性细胞。As2S2处理组可明显降低PCNA蛋白的阳性表达(见表2)。与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。
3 讨论
肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，预后差。以化疗为主的综合治疗对于不能手术切除的肝癌仍是目前主要的治疗手段。但由于传统化疗药物存在副作用大、敏感性低、易产生多药耐药性等缺点而效果不佳，因此寻求新的有效的化疗药物对于肝癌的治疗有重要意义。
近年来，雄黄在临床上已成功用于白血病的治疗，并开始应用于抗其它血液系统恶性肿瘤及实体瘤的研究。庞琦等[5]建立胶质瘤动物模型，雄黄局部注射治疗肿瘤，体外实验也证实雄黄对肺腺癌细胞、骨肉瘤细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞及卵巢癌细胞都有抑制增值并诱导凋亡的作用[6-10]。目前研究认为雄黄抗肿瘤作用的机制可能为：①诱导肿瘤细胞凋亡；②抑制肿瘤细胞增殖；③促进肿瘤细胞分化；④抗肿瘤血管生成[3]。
张晨[11]报道，雄黄对人肝癌细胞株BEL-7402有明显细胞毒作用，不仅可抑制肝癌细胞的生长增殖，并且可诱导细胞凋亡的产生，实验组中与细胞凋亡相关的两种蛋白Ap02.7和Fas均有表达增加的趋势。黄姣娥等[12]报道雄黄对人肝癌细胞株BEL-7402的抗肿瘤作用机制与升高细胞内钙、降低细胞线粒体膜电位并诱导细胞凋亡有关。
该实验通过MTT法也观察到相似的结果，在15~120 mg/L浓度范围内，As2S2能抑制QGY-7703细胞的生长，抑制作用随着药物浓度的提高、作用时间的延长而增强，呈时效和量效关系。该研究免疫细胞化学结果显示，正常培养的QGY-7703细胞，PCNA阳性表达率较高，经As2S2作用48 h后，PCNA的表达明显下降，其降低程度与药物浓度呈明显的正相关。据此推测，As2S2抑制细胞增殖的可能机制之一是抑制了参与DNA合成的PCNA，从而导致DNA合成受阻，进而抑制了细胞增殖。
该研究中，QGY-7703细胞的自发凋亡率较低，可部分解释肝癌对放疗敏感性较差这一现象。As2S2以15 mg/L、30 mg/L、60 mg/L三个浓度分别作用于QGY-7703细胞48 h、72 h。与对照组比较，试验组QGY-7703细胞的凋亡率不同程度增加，但并非呈时间依赖性和浓度依赖性。随着药物浓度的提高和作用时间的延长，细胞凋亡率反而降低，表现为以继发性坏死细胞为主。表明As2S2在一定的浓度范围内具有诱导QGY-7703细胞凋亡的作用，但随着作用时间增加和浓度的提高则表现出细胞毒作用，促进肿瘤细胞坏死。
该实验仅是雄黄对肝癌细胞作用的初步研究，因其未设阳性对照组，仅以一株肝癌细胞为研究对象，且尚未进行动物体内的抑瘤实验，有待今后增加对肝癌细胞系的研究，并对其机制作进一步深入探讨。
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参考文献
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(收稿日期：2014-11-20)