张积广
福建省立医院胸外科，福建福州 350001
[摘要] 目的 研究microRNA-101 (miR-101)对紫杉醇诱导非小细胞肺癌细胞凋亡的影响，并探讨其潜在机制。方法 将 miR-101mimics、siRNA-EZH2转染到非小细胞肺癌细胞中；应用流式细胞学annexin V/PI双染法检测细胞凋亡；应用Western blot检测凋亡相关蛋白EZH2, Bim 和 cleaved PARP的表达。结果miR-101过表达或EZH2基因沉默促使紫杉醇诱导的非小细胞肺癌细胞凋亡,与相应的阴性对照组相比凋亡细胞数量分别为2.4倍及2.2倍，；miR-101抑制EZH2表达并增强凋亡相关蛋白Bim和cleaved PARP的表达，,与相应的阴性对照组相比Bim和cleaved PARP的表达分别为1.8倍及2.7倍。结论 miR-101增强紫杉醇诱导非小细胞肺癌细胞凋亡。其机制可能为miR-101介导的EZH2低表达诱导凋亡相关蛋白Bim生成，因此促进紫杉醇诱导肺癌凋亡。
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关键词 微小RNA-101；EZH2基因；非小细胞肺癌；细胞凋亡；紫杉醇
[中图分类号] R739.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１4）10（b）－０055-03
[基金项目] 福建省自然科学基金资助项目（2012J05136）；福建省卫生厅青年科研基金资助项目（212-2-2）。
非小细胞肺癌的发病率及病死率高，对放化疗不敏感，疗效欠佳。紫杉醇是非小细胞肺癌治疗的一线化疗药物，临床应用较广泛，其抗肿瘤机制主要是通过凋亡促使肿瘤细胞死亡，而凋亡抵抗是恶性肿瘤细胞的一个重要生物学特征，严重降低紫杉醇的治疗效果，因此有效提高紫杉醇促凋亡功能，可增强其抗肿瘤作用，提高其疗效。microRNA是单链非编码小分子RNA，其在转录后水平调控基因的表达，是肿瘤学近年研究的热点，据文献[1]报道miRNA可改变肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。该研究起止时间为2013年1月—2014年5月，旨在阐明miR-101促进紫杉醇诱导非小细胞肺癌细胞凋亡，并探讨其可能机制，现报道如下。
1方法
1.1细胞培养
H358 (支气管肺泡癌)和 H226 (鳞癌)细胞株购自ATCC，细胞株在含10% FBS、含双抗(100 IU青霉素和100 μg/mL链霉素)的RPMI-1640培养液中培养。
1.2miRNA-101mimics和siRNA的细胞转染
按照Lipofectamine 2000说明书的步骤进行转染。将适当数量肺癌细胞接种于96孔或6孔板，细胞汇合度达到50%~60%时进行转染，转染后6 h，更换培养液为含10%FBS的DMEM。
1.3实时定量PCR
用Trizol从细胞中提取总RNA。
①microRNA-101表达检测
按逆转录试剂盒说明书将miRNA 逆转录为cDNA，将逆转录产物进行实时定量PCR扩增，反应体系如下。
2×Real-time PCR Buffer 10 μL，miR specific Primer set(5μmol/L) 0.6μL miRNA RT product (物稀释3倍) 2 μL ，Taq DNA polymerase（5 U/μL） 0.2 μL ，dd H2OTo 20 μL。混匀上述各组分，95 ℃ 3 min, 95 ℃ 12 s， 58 ℃ 40 s，40 个循环，PCR反应在ABI 7500荧光定量PCR仪上完成。U6作为内参，用2-△△ct 法计算。该实验重复3次。
②EZH2-mRNA表达检测
按逆转录试剂盒说明书将RNA 逆转录为cDNA，将逆转录产物进行实时定量PCR扩增，反应体系如下。
上、下游引物各(10 μmol/L) 1 μL， SYBR Green Real-time PCR Master Mix 12.5 μL，逆转录产物(稀释10倍) 1 μL，Add H2O to final 25 μL。将上述各部分混匀。95 ℃60 s；95 ℃15 s，56 ℃15 s，72 ℃45 s，共40 个循环。
1.4Western Blot
每个孔均加入细胞裂解液充分摇匀， 在冰上作用30 min后进一步离心后吸取上清液，蛋白浓度用Bi-Rad蛋白测定试剂盒测定，-70℃保存于深低温冰箱。取30 μg样品进行凝胶电泳、转膜，在 室温下封闭 1 h后分别与相应一抗、二抗充分相互作用， 最后用ECL化学发光试剂进行检测。将胶片进行扫描，用凝胶图像处理系统分析。
1.5细胞凋亡检测
将肺癌细胞接种于6孔板中，转染方法同前，将每种细胞分为4组即siRNA-EZH2 组、siRNA阴性对照组及转染miR-101组、miRNA阴性对照组。将紫杉醇（终浓度为40 nmol/L）加入转染72 h后细胞，并孵育48 h。将收集的每组细胞分为俩份，一份用于Annexin V-FITC凋亡检测，而另外一份用于western blot检测凋亡相关蛋白，按试剂盒说明操作。
1.6统计方法
所有数据均以spss13.0统计软件包进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示。
2结果
2.1miR-101过表达或EZH2基因沉默增强紫杉醇诱导的肺癌细胞凋亡
非小细胞肺癌H358和H226细胞株对紫杉醇的药物敏感性低，因而被用于该研究。EZH2是miR-101的靶基因，具有癌基因特性，促进非非小细胞肺癌的发生发展，因此将沉默EZH2表的siRNA-EZH2作为阳性对照。miR-101 mimics 或siRNA-EZH2转染细胞 72 h后再加入紫杉醇培养48 h，用流式检测细胞凋亡，结果表明miR-101过表达或EZH2基因沉默(图A)显著增强肿瘤细胞对紫杉醇敏感性，导致肿瘤细胞凋亡数量显著上升(图B和图C)。
2.2miR-101抑制EZH2表达并增强凋亡相关蛋白Bim和cleaved PARP的表达
为了研究miR-101增强肿瘤细胞对紫杉醇敏感性的可能机制，同时我们亦收集上述与紫杉醇培养48 h后的肺癌细胞，用于检测凋亡相关蛋白。既往研究提示促凋亡蛋白Bim是决定肿瘤细胞对紫杉醇敏感性的重要因子[2]，而EZH2抑制Bim表达[3]，所以我们检测凋亡相关蛋白EZH2、Bim、和cleaved PARP的表达。该实验结果表明，EZH2蛋白在miR-101 和siRNA-EZH2转染细胞组的表达水平显著低于相应的阴性对照组，而Bim和cleaved PARP蛋白在miR-101 和siRNA-EZH2转染细胞组的表达水平显著高于相应的阴性对照组 (图D 和图E)。
3讨论
非小细胞肺癌对化学药物治疗不敏感，且预后通常欠佳[4-6]，这种状况在过去的几十年中并未得到改善。紫杉醇是当前广泛应用于非小细胞肺癌治疗的临床一线药物，主要通过诱导细胞凋亡导致肿瘤细胞死亡，虽然其取得一定临床治疗成绩，但并不理想，若能进一步提高其疗效则有益于肺癌患者。因此，检测miR-101能否增进紫杉醇诱导的非小细胞肺癌细胞凋亡及其可能的机制值得进一步深入研究。该研究显示提高miR-101表达或沉默EZH2基因均能促进紫杉醇诱导肺癌细胞凋亡，同时亦降低EZH2蛋白表达和增强Bim蛋白表达。先前文献研究显示Bim能增进非小细胞肺癌细胞对紫杉醇的药物敏感性，而下调Bim基因表达则显著减少紫杉醇导致的非小细胞肺癌细胞死亡，此表明Bim是连接紫杉醇和凋亡之间的一个重要分子。EZH2已经被证实能通过后生性抑制Bim表达而减少肿瘤细胞凋亡。结合上述科研成果，研究结果提示miR-101调节紫杉醇诱导非小细胞肺癌凋亡的机制如下：由miR-101介导的EZH2低表达诱导Bim蛋白生成，因此增强紫杉醇诱导的非小细胞肺癌凋亡。
综上，在非小细胞肺癌中miR-101能增强紫杉醇诱导的肺癌细胞凋亡。该研究结果提示miR-101和EZH2可能成为临床非小细胞肺癌治疗的潜在新靶点，有望改善非小细胞肺癌患者的临床治疗效果。
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参考文献
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（收稿日期：2014-07-14）