王祖哲，王利，顾晨雷，马普，王秀利1*
（大连海洋大学水产与生命学院，辽宁 大连116023）
刺参（Apostichopus japonicus）分类学上隶属于棘皮动物门、游走亚门、海参纲、楯手目、刺参科，是重要的经济海参物种[1]。刺参含有丰富的蛋白质、酸性黏多糖、维生素、氨基酸、海参皂苷以及多种微量元素和生理活性物质，具有很高的营养、保健和药用价值。其中以产于我国辽宁、山东沿海的刺参营养、药用价值最高。随着人们生活水平的提高，刺参市场需求量显著增加。20世纪80年代以来，随着海洋经济快速发展，我国刺参增养殖随之迅猛发展，已经形成了产业化。据不完全统计，我国刺参产量产值每三至五年翻一番。目前，刺参的年产量已接近20万吨，产值达到300亿元以上，刺参已经成为我国水产业单种产值最高的经济物种之一。
随着刺参养殖产业的发展，必须加强刺参生物学特性、遗传多样性、功能基因的开发与利用等等方面的研究，才能科学开展刺参新品种的培育与健康养殖。在科研工作中，以PCR技术为核心的分子标记技术如限制性片段长度多态性（RFLP）、扩增片段长度多态性（AFLP）、微卫星（SSR）、单核苷酸多态性（SNPs）等遗传信息的分析在水产动物遗传育种、遗传多样性研究等方面已经得到广泛应用。为获得高质量的刺参基因组DNA，冯志纲等（2008）和孙孝德等（2010）进行了刺参基因组DNA提取方法的探讨，但他们都是采用活体刺参即时采样，即时提取[2-3]。而在实际科研工作中，科研工作者往往需要到刺参养殖场进行采样，通过将刺参样品保存在70%的乙醇固定液中带回实验室。常规的酚-氯仿抽提法虽然适用于各种动物组织DNA的提取，简单易行，一般实验室即可操作，但由于刺参含有丰富的黏多糖和蛋白质[4]，所以该方法应用于刺参DNA提取时效果并不理想。本研究优化与改进了酚-氯仿抽提法对适应70%乙醇固定保存的刺参组织样品中基因组DNA的提取，为获得高质量刺参基因组DNA提供方法保障。
1材料及方法
1.1样品采集
实验所用刺参取自大连某养殖场，用70%乙醇[5]固定刺参体壁后带回实验室于-20 ℃保存备用。
1.2常规的酚-氯仿抽提法提取刺参基因组DNA
常规酚-氯仿抽提法见教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献[6]。
1.2.1样品处理取保存在70%乙醇中的刺参体壁样品约0.2～0.4 g，用滤纸将酒精尽可能地吸干，放入灭菌的1.5 mL离心管，用剪刀剪碎。
1.2.2水浴向1.5 mL离心管中加入600 μL DNA提取液（10 mmol/L Tris-Cl，0.1 mol/L EDTA，0.5% SDS）和蛋白酶K（20 mg/mL）至终浓度100 μg/mL后充分混匀，放入恒温55 ℃水浴锅中消化，水浴时每隔15 min翻转一次，直到消化完全。
1.2.3萃取将溶液冷却至室温，①加入等体积的用0.1 mol/L Tris-Cl（pH 8.0）平衡过的苯酚。将离心管置于旋转器上，使离心管缓慢颠转10 min以温和地混合两相。12 000 r/min，离心15 min，分离两相。②取上清，加入苯酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）混合液轻柔混匀10 min，以12 000 r/min，离心10 min。③取上清，加入等体积氯仿轻柔混匀10 min，以12 000 r/min，离心10 min。
1.2.4沉淀DNA在取出的上清液中加入2倍体积的-20 ℃预冷的无水乙醇，充分混匀后放在-20℃冰箱中2 h，然后以12 000 r/min，离心15 min，弃上清。
1.2.5洗盐加入70%乙醇500 μL洗涤，12 000 r/min，离心5 min，弃上清后重新6 000 r/min离心5 min。取出离心管倒置在滤纸上数分钟，吸干剩余液体。
1.2.6溶解DNA加入200 μL 1×TE以及2 μL RNA酶轻弹混匀后，放置于4 ℃过夜备用。
1.2.7检测制备1%的琼脂糖凝胶，用EB显色，3 μL的DNA模板与3 μL的6×Loading buffer混匀上样，120 V电泳20 min，电泳结果经凝胶成像显示DNA的质量，用微量核酸蛋白检测仪（NV3000）测定DNA的纯度与浓度。
1.3改进的刺参基因组DNA提取方法
将1.2.2中裂解液EDTA的浓度提高了10倍，为1 mol/L。
将1.2.3中①加入等体积Tris-平衡酚调整为酚/仿6：1（v/v）。将1.2.3中②、③步中苯酚/氯仿/异戊醇、氯仿混匀时间缩短为5 min。将1?2.3萃取后增加3次氯仿抽提次数。
1.4DNA提取试剂盒
应用天根生化科技有限公司DNA提取试剂盒，按照说明书的方法对70%乙醇保存的刺参样品进行基因组DNA提取。
1.5PCR扩增
1.5.1微卫星位点选择选取刺参微卫星序列（GenBank No.EF032102），设计引物，扩增的目的片段大小为237bp。 上游引物序列：5′–TCCGACTTTTAGGACCAGAT–3′；下游引物序列：5′–TGGGTTTTCACCTCAGACG–3′。
1.5.2PCR反应体系25 μL体系，包括10×PCR buffer（Mg2+ Plus）2.5 μL，dNTP 2μL；上、下游引物（10 M）各2 μL，DNA模板1 μL，TaqE（5 U/μL）0.5 μL；ddH2O 15 μL。
1.5.3PCR扩增程序94 ℃预变性5 min；进行如下26个循环：94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸7 min。
2结果与讨论
本研究采用常规的酚-氯仿抽提法、改进方法和公司试剂盒的三种方法对70%乙醇保存的刺参体壁组织样品进行基因组DNA的提取，DNA提取结果见图1。由图1可见，常规的酚-氯仿法和试剂盒提取的DNA，从琼脂糖凝胶电泳图可以看出提取的基因组DNA有降解、凝胶孔中存在大分子杂质。而改进的酚-氯仿法提取的DNA，从琼脂糖凝胶电泳图可以看出提取的基因组DNA条带清晰、整齐，说明提取的基因组DNA分子较完整、无杂质、基本没有降解。经微量核酸蛋白检测仪测得常规的酚-氯仿法和试剂盒提取的基因组DNA在260 nm和280 nm的光密度值的比值（A260/A280）分别为1.26和1?49，远远小于1.8，说明DNA中有蛋白等杂质的存在；而改进的酚-氯仿法法提取的基因组DNA的A260/A280为1.89，在理想值范围。常规的酚-氯仿抽提法提取的DNA浓度为404 μg/mL，试剂盒法提取的DNA浓度为319 μg/mL，改进的酚-氯仿法法提取的基因组DNA的浓度为389 μg/mL。
（a常规的酚-氯仿方法、b为试剂盒方法、c改进的酚-氯仿方法）
图2为以上述三种方法分别提取的基因组DNA为模板，以刺参SSR的一对引物所进行的PCR扩增，从图2的A、B中可以看出，用常规的酚-氯仿法和试剂盒提取的DNA做模板得到的PCR产物有杂带，不能用于诸如目的基因片段的连接等实验。而用改进的酚-氯仿法提取的DNA做模板得到的PCR产物条带单一清晰，可用于后续实验。
分子标记技术是建立在PCR基础之上的，而模版DNA的质量又是影响PCR扩增的关键因素。因此如何得到更高质量的刺参基因组DNA至关重要。尽管有以活体取管足等组织提取刺参基因组DNA，但对于保存在70%乙醇中的刺参样品提取高质量DNA的报道文献不多。经过多次反复应用常规的酚-氯仿法和试剂盒进行刺参基因组DNA的提取，提取的效果很不理想，这主要是由于刺参体内黏多糖和蛋白质含量相当丰富。本文针对刺参的生物学特点，在对刺参组织样品进行消化时，将裂解液中EDTA的浓度提高了10倍。因为EDTA具有拆解蛋白质的能力，这就分担了后面酚仿萃取时的压力。同时，针对刺参DNA提取过程中极易降解的特点，我们改变了酚仿抽提时间和次数。本实验的结果表明：以改进的酚-氯仿法提取的刺参基因组DNA，其A260/A280比值理想；从SSR-PCR扩增结果来看，以改进的酚-氯仿法提取的刺参基因组DNA为模版扩增的PCR产物效果更好。
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参考文献：
[1] 王颖，仇雪梅，王娟，王秀利.刺参病害现状及其生物技术检测的研究进展[J].生物技术通报，2009 （11）： 60-64
[2] 冯志纲，于佳平，丁君，等.仿刺参基因组 DNA 提取方法改进[J].生物技术通报 （S1）： 2008年增刊：352-355
[3] 孙孝德，孙国华，杨建敏，等.刺参基因组 DNA 提取的探讨[J].生物技术通报，2010（3）：149-153
[4] 苏秀榕，娄永江，常亚青，等.海参的营养成分及海参多糖的抗肿瘤活性的研究[J].营养学报，2003，25（2）： 181-182
[5] 刘保忠， 宋林生，相建海.海湾扇贝样品不同保存条件下 DNA 的提取及 RAPD 扩增比较[J].海洋科学，2001， 25（3）： 51-53
[6] Sambrook J， Fritsch E F， Maniatis T. Molecular cloning [M]. New York： Cold spring harbor laboratory press， 1989
（收稿日期：2014-05-05；修回日期：2014-05-08）