摘 要：环状RNA(circRNA）是一种自然存在于生物体内，呈共价闭合环状结构的内源性非编码RNA(ncRNA），具有调控基因表达的重要生物学作用。其通过作为微小RNA(miRNA）在环状RNA-miRNA-mRNA轴中发挥作用，调节可变剪接以及亲本基因表达。近年来随着技术的发展，人们逐渐发现了具有独特生物学特性的环状RNA在临床疾病预测、早期干预及诊断治疗等方面具有广阔的发展空间，成为近年的研究热点。但环状RNA在妇产科非肿瘤方面研究相对较少，故本文简要介绍环状RNA并对其在人类生殖与妊娠方面非肿瘤相关疾病的研究进展进行概述。
关键词：环状RNA 生殖 妊娠 复发性流产 产前诊断
新进入人们视野的环状RNA广泛存在于真核细胞质中，是具有调控基因表达作用的内源性非编码RNA分子。不同于以线性拼接方式形成的RNA，环状RNA呈闭合环状结构，无5′端帽子和3′端尾巴。人们最早从病毒及类病毒中得到对环状RNA认知[1]，但早期的研究者认为环状RNA是RNA产生过程中发生了错误的剪接而形成的，无明确的生物学功能，从而使其未得到重视和充分的研究[2]。随着近年来高通量测序技术的发展，环状RNA不断从各种真核生物细胞中被发现[3-4]，使人们不断对其功能进行深入研究。因其特殊的生物学特性，环状RNA在疾病的发生发展机制及早期诊断方面成为近年来的热点研究项目[5]。目前环状RNA在人类生殖与妊娠方面的相关研究较肿瘤相关疾病要少的多，因此本文将简要介绍环状RNA的形成、特性及生物学功能，并重点着眼于环状RNA在不孕症辅助生殖、复发性流产（recurrent spontaneous abortion,RSA）、妊娠合并症及产前诊断中的相关研究及应用前景。
1 环状RNA简介
1.1 环状RNA的形成
环状RNA的产生机制及过程尚未彻底明确，其目前主要可分为五类，包括外显子来源的环状RNA(ecircRNAs）、内含子来源的环状RNA(ElciRNAs）、环状基因组间RNA（包括类病毒和丁型肝炎病毒）、RNA加工过程中的环状RNA中间产物（tRNA或r RNA加工过程中的中间体）、具有持家基因功能的环状RNA(ciRNAs)(RnaseP或某些snoRNA)[6]。在环状RNA的形成机制上，最早由Jeck等[7]提出RNA成环模型，即套索驱动环化和固有配对环化。环状RNA分子主要是由反向拼接形成，即下游外显子与上游外显子反方向拼接在一起形成环状转录物。此外，环状RNA还有另一种形成模式，即依赖于RNA结合蛋白。剪接因子Quaking(QKI)[8]和Muscleblind(MBL)[9]，作为连接2个侧翼内含子相互靠近的桥梁促进环状RNA形成。因此推测RNA结合蛋白在RNA环化过程中起重要作用，通过互补序列桥梁和抑制典型拼接促进环化。以上为可能性较大的学说，环状RNA具体形成机制仍需进一步研究证实。
1.2 环状RNA的特征
目前发现环状RNA的特征包括以下几个方面。(1)高丰度：与线性mRNA相比，环状RNA是分布在人类细胞中最普遍的分子。(2)稳定性：环状RNA是共价闭合环状结构，因此可避免被脱支酶和核酸内切酶降解。(3)物种保守性：环状RNA在不同物种中具有进化过程的高度保守性[10]。(4)环状RNA在不同组织及发育的不同阶段具有特异性[11]。(5)环状RNA在真核生物中主要分布于细胞核，且可能在转录或转录后过程中调节基因的表达，ecirc RNA主要分布于细胞质中，可能与miRNA的功能特性有所重叠[12]。(6)某些环状RNA包含miRNA拼接位点，可竞争性抑制内源性miRNA的调节活动[7]。
1.3 环状RNA的生物学功能
环状RNA在真核细胞中可与多种分子相互作用，其生物学功能可概括为以下五种：(1)部分环状RNA可充当miRNA竞争结合miRNA受体，降低miRNA对靶基因的抑制作用，从而调节靶基因的表达水平[13]。(2)环状RNA可与m RNA部分碱基配对，直接调控m RNA，也可通过特异的RNA-RNA途径来调控转录过程[14]。(3)环状RNA可通过调节亲本基因的表达参与生物学过程的调控。外显子来源的ecirc R-NA及内含子来源的ElciRNAs主要位于细胞核内，通过聚合酶Ⅱ和小核糖核蛋白相互作用调控亲本基因转录。(4)环状RNA可通过与蛋白结合抑制蛋白活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性。Du等[15]发现环状RNA-Foxo3可与细胞周期依赖激酶2(CDK2）形成复合体，抑制CDK2对细胞分裂的促进作用，阻碍细胞周期进展。(5)环状RNA可翻译为蛋白质。有研究证明[16]，哺乳动物或人类细胞中的环状RNA可以不依赖任何核糖体进入位点、Poly A尾或帽子结构，以滚环式扩增，翻译出足量的蛋白产物。
2 环状RNA与人类生殖
随着人们生活压力、环境污染及饮食安全问题等的加剧，不孕不育的发病率在逐年上升，生殖医学也随之蓬勃发展，但也有许多治疗困难或多次移植失败的病例，为此了解在环状RNA领域与人类生殖疾病，如不孕症、RSA的相关研究进展，从中可能找出提高成功率的方法。不孕症的定义是夫妇有规律性生活、未采取任何避孕措施至少1年未受孕。不孕症的发生受许多因素影响，这里只简要介绍在环状RNA领域研究较多的不孕症相关因素。
2.1 环状RNA与女性不孕
可明确的女性不孕原因较多与环状RNA研究相关的疾病有多囊卵巢综合征（PCOS）、子宫内膜异位症（EMs）等。Che等[17]的研究在20例PCOS患者中筛选出与对照组表达差异明显的4个环状RNA，并发现其相应的microRNA结合位点与PCOS疾病相关。Ma等[18]检测出在PCOS患者的卵丘细胞中有286个环状RNA差异表达，斯皮尔曼等级相关（Spearman rank correlation）系数表明PCOS组中血清睾酮水平与hsa＿circ＿0043533和hsa＿circ＿0097636的表达成正相关。分析显示环状RNA可能参与细胞周期、卵母细胞减数分裂、孕酮介导的卵母细胞成熟、FOXO信号通路及甘油磷脂代谢等。Zhang等[19]则发现PCOS组颗粒细胞中27个显着差异表达的环状RNA，在涉及炎症、增殖和与血管内皮生长因子相关的信号传导途径中发挥作用，表明这些环状RNA参与了PCOS的发生发展，并存在作为PCOS生物标志物的可能。
EMs是指因内膜细胞种植到子宫腔以外的部位而导致的以痛经和不孕为表现的一种妇科疾病，其发病机制目前不明。有研究[20]对4对卵巢巧克力囊肿及子宫在位内膜检测，筛选出553个差异表达的环状RNA，涉及9个信号转导通路可能与EMs的发病机制相关。Wang等[21]的研究结果筛选发现294个环状RNA差异表达，功能分析揭示了它们与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路和磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT）信号通路等的调控相关，可能是该病发病机制及治疗靶点之一。还有研究[22]发现hsa＿circ＿0067301/miR-141-5p/Notch-1轴在EMs的上皮-间质转化过程中起着重要的调节作用，提示了EMs发病机制的分子基础。临床辅助生殖中胚胎的反复移植失败亦是不容忽视的问题之一，已有研究[23]以环状RNA微阵列技术筛选出反复植入失败的女性子宫内膜活检组织中的环状RNA表达谱，结果表明，有856种环状RNA有显着表达差异，其中hsa＿circ＿070 616,hsa＿circ＿103716等七种最为明显，有成为临床辅助生殖提高移植成功率新标志物的价值。
此外亦有女性生殖系统结核等，关于结核病与环状RNA的研究已有多篇文献报道[24-26]人外周血单个核细胞中表达的hsa＿circ＿0005836、hsa＿circ＿001937等数个具有生物标志物前景的环状RNA，但未明确提到女性生殖器结核，仍需进一步研究。
2.2 环状RNA与男性不育
导致男性不育的因素很多，包括先天性的睾丸发育不良、睾丸炎、输精管梗阻、睾丸萎缩、免疫性不育、内分泌失调等，除上述因素外，精子畸形、无精、少弱精等更为常见。Dong等[27]通过高通量测序技术揭示了人类睾丸组织中的环状RNA谱，对首次发现能产生环状RNA的1017个宿主基因进行基因本体论（gene ontology,GO）分析，结果显示，这些基因与精子发生、精子运动、减数分裂细胞周期和受精作用等过程相关。李颖[28]的研究显示，约83%精子环状RNA为外显子来源环状RNA，而差异表达的环状RNA在精子鞭毛、鞭毛轴丝、甲基转移酶活性等方面富集较多。研究筛选出了hsa＿circ＿MYO9B、hsa＿circ＿WHsci(8）等五条环状RNA，检测结果发现hsa＿circ＿WHSCI(8）、hsa＿circ＿WHSCI(6）、hsa＿circ＿CAMSAP1三种环状RNA在弱精组中的表达水平显着上调。另有学者[29]研究发现，DAZ(Deleted in Azoospermia）家族基因中Boule基因上产生的环状RNA可能参与调控Boule的生殖特异表达，从而影响男性的少弱精症。环状RNA的高稳定性使其在精浆等体液中可以被检测，未来具有成为男性不育疾病标志物的临床价值。
2.3 环状RNA与RSA
RSA是生殖医学研究中的重要课题之一，美国生殖医学学会将≥2次的妊娠失败定义为RSA[30]。导致RSA的因素并不完全明确，基因表达异常是发生RSA的重要因素，故环状RNA在RSA的病因及发病机制的深入研究中有着重要的作用。Qian等[31]对RSA孕妇与正常孕妇的绒毛膜组织中的环状RNA表达进行差异性分析，结果显示，hsa＿circ＿104948、hsa＿circ＿104547等8种环状RNA在两组之间有显着的差异性表达，进一步分析表明，绒毛中环状RNA的差异性表达可能与其充当miRNA调节靶基因的表达水平的功能相关。目前对与RSA相关的环状RNA的研究较少，未来仍有广阔的研究空间。
3 环状RNA与妊娠
3.1 妊娠合并症
临床产科常见的妊娠合并症有妊娠期糖尿病（gestation diabetes mellitus,GDM）、妊娠合并高血压疾病、胎盘异常等，严重的妊娠合并症可导致不良的妊娠结局，甚至威胁母儿生命。以环状RNA的生物学特性在未来有可能用于早期预测妊娠合并症的发生，从而指导临床工作者得以提前预防或干预。子痫前期（preeclampsia,PE）具有发病迅速、病情进展快等特点，在妊娠合并高血压疾病中是造成不良母儿结局较多的一种[32]，有多项研究[33-35]从患有PE孕妇的血细胞或胎盘组织中筛选与正常孕妇组表达差异较大的环状RNA，而Zhang等[34]发现12种环状RNA呈现明显的差异性表达，其中hsa＿circ＿101222的表达差异更是高达10倍左右，提示其可能作为PE的诊断标志物以辅助临床，但Prefumo[36]也提出距离环状RNA正式进入临床作为检测指标还有很多的困难需要克服。
GDM是指妊娠期首次发生任何程度的由糖耐量异常引起的高血糖，在中国的发病率高达14.8%[37]，其具体原因及发病机制尚未明确，可能与遗传、胰岛素分泌等因素有关。近年有研究[38]通过检测孕妇外周血中环状RNA丰度表达发现，GDM孕妇和正常孕妇有2678个差异表达倍数>2.0的环状RNA，其中hsa＿circ＿0042852、hsa＿circ＿0004001两种环状RNA及其参与的调控网络与调节能量代谢的信号通路相关，提示了环状RNA可能参与调控GDM发病机制的某些代谢环节。Yan等[39]发现GDM孕妇胎盘绒毛中227种环状RNA表达显着增高，255种明显降低，并存在大量的GDM发病相关的miRNA结合位点，提示环状RNA的异常表达可能与GDM的发生相关。还有研究[40]检测出GDM孕妇胎盘组织中有46个环状RNA差异表达明显，分析结果提示这些环状RNA的来源基因与内分泌抵抗以及晚期糖基化终产物受体通路（AGE-RAGE）有关，在多种糖尿病并发症中发挥重要作用，并与GDM的不良妊娠结局密切相关。
3.2 产前诊断
胚胎发育是一个复杂的过程，环状RNA在胚胎发育过程中可能具有独特而重要的功能，可作为研究胚胎发育不同阶段的标志物。Xu等[41]的研究系统检测出了胎儿与成人各类组织中含有的环状RNA表达水平并不相同。而在人类胎儿脑部的发育期间，环状RNA在某些特殊区域富集较为明显[42]。在临床应用中，随着转录组测序（RNA-seq）技术的发展，以体液中的环状RNA作为检测指标具有较强的发展潜力及可操作性。目前应用广泛的产前筛查主要使用全基因组测序学方法来研究人类三体征（包括13-三体、18-三体和21-三体综合征），以鉴定这些特定非整倍性染色体中的每一个基因表达特征。林南新等[43-44]研究得到了13-三体综合征患者脐带血或母血中差异表达的环状RNA，并推测hsa＿circ＿0002473、hsa＿circ＿0005 651等环状RNA及其靶基因可能成为13-三体综合征无创性产前筛查诊断的新生物标志物；而hsa＿circ＿0001649可能成为18-三体综合征潜在的新标志物[45]。常燕[46]的研究显示hsa＿circ＿103112在21-三体综合征患儿的脐带血及其母体外周血均有显着差异性表达，其靶基因USP25也与临床症状的产生有关，可能成为21-三体综合征的临床标志物。
4 小结与展望
因环状RNA拥有广泛性、稳定性、特异性等生物学特性且具有调控基因表达的重要功能，近年来逐渐成为生物医学领域的研究热点，但目前仅少量研究环状RNA与人类生殖及妊娠相关。随着生物信息及测序技术的发展，环状RNA在人类繁衍、优生优育方面具有广阔的研究价值及发展前景。
环状RNA可以被分泌至细胞外环境中，可通过临床普遍检测标本如血液、尿液、分泌物等检测出来，用于临床诊断或研究较为方便。目前的相关研究主要流程为找出患病组较正常组独特上调或下降表达的某些环状RNA，构建环状RNA-miRNA-mRNA相关网络，并分析其与某些蛋白或信号通路的关联，从而揭示疾病的病理发病机制并期望以之作为生物标志物应用于临床早期预测干预以及治疗。但如何从大量差异表达的环状RNA中较为准确地筛选出与目标疾病相关联的某一个或几个还是目前亟待改善的问题，实验室的研究成果距离临床应用亦有很长的一段路要走，尚需生物技术与器材的继续发展和对基因调控研究的继续深入。研究人员对已知的差异调控的环状RNA进行深入挖掘及大数据分析可能促进环状RNA与疾病关系的进一步确定，从而加快临床应用的步伐，这需要研究者们的共同努力。
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