doi：10.13360/j.issn.1000-8101.2015.04.011中图分类号：S718.46
胡杨大片段基因在拟南芥中的表达及耐盐性分析
张瑷，何丽君*，黄鹏，王文娟，杨海峰
（内蒙古农业大学，呼和浩特 010019）
摘要：以根癌农杆菌为介导，利用拟南芥作为受体植物进行胡杨基因大片段的转化。共将1 570个胡杨BIBAC 克隆进行了拟南芥转化实验，其中利用抗生素平板筛选，有590个克隆得到了转基因拟南芥，利用PCR进行检测后得到结果跟卡那平板筛选后的结果吻合。对得到的转基因拟南芥进行不同浓度NaCl筛选（150和175 mmol/L），共得到10个有耐盐表现的克隆；进一步验证试验证实，有两个株系具有稳定的耐盐表现，分离出T2纯合系。对于所获得的转化子进行播种观察得到了两个表型变化的突变体。本研究对于解析胡杨耐盐机理及挖掘胡杨耐盐基因资源具有重要意义。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ：拟南芥；转基因；盐胁迫；阳性转化子
收稿日期：2015-01-14
修回日期：2015-03-12
基金项目：国家自然科学基金项目（31360187）；内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZY13076）；中国林业科学研究院中央级公益性科研院所基本科研业务专项资金项目（CAFYBB2011001）。
作者简介：张瑷（1987-），女，硕士生，主要从事林木遗传育种等方面的研究。通信作者：何丽君，女，副教授。E?mail：zhangaian123@163.com
The expression of Populus euphratica large fragment gene in Arabidopsis and salt tolerance analysis
∥
ZHANG Ai， HE Lijun， HUANG Peng， WANG Wenjuan， YANG Haifeng
Abstract：Mediated with Agrobacterium tumefaciens， we took Arabidopsis thaliana as the receptor plant and transferred large gene fragments of Populus euphratica into it. Totally， 1 570 BIBAC clones of P. euphratica were transferred in this research and 590 from these clones got the Arabidopsis thaliana transformants by screening on antibiotic containing plate. Then PCR identification screening proved the results from antibiotic screening. These transformants of A.thaliana were screened on the different salt stresses of NaCl （150 and 175 mmol/L and 10 clones could express salt tolerance. In these clones， two among them showed the stable salt tolerance and homozygote were gotten in the further experiments .The phenotype change of 2 mutant strains were found in seeding experiments. The research would be meaningful for salt?tolerant mechanism and gene?tic resources of P.euphratica.
Key words： Arabidopsis；transgenic；salt stress；positive transformation
Authors’ address： Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010019， China
由于拟南芥包含了所有开花植物的基因密码，基因组在已知高等植物中最小，基因重复序列最低，生命周期短［1-2］等特点，长期以来被视为传统遗传学和分子生物学研究的模式植物材料［3］。
胡杨（Populus euphratica Oliv.）作为干旱荒漠盐碱地唯一能够成林的高大乔木树种，是典型的耐盐多年生木本植物，也被作为木本植物研究的一个理想的模型系统［4-5］。近年来许多国内外学者在研究植物对逆境的适应、探索植物耐盐碱机制［6-7］方面做了大量工作。樊军锋等［8］在对‘84K’杨进行了双价耐盐基因mtlD/gutD 的转化研究中，获得了3株不同程度NaCl抗性的转基因植株。在马焕成等［9-10］的研究中发现胡杨对盐分并不是简单的拒吸机制。马挺军等［11］报道胡杨细胞经50 mmol/L NaCl处理10 d后，液泡膜H+-ATPase，PPiase水解活性都增加了，说明胡杨具有盐生植物的特性，然而以上研究仅局限在生理层面，对于胡杨耐盐、耐旱等的分子机制及其调控网络模式尚在研究中。现代基因组学技术的应用为培育优质、高抗，适应不良环境条件的优良品种提供新的途径。如Chen等［12］曾从胡杨中分离出一种钙离子依赖的蛋白激酶PeCPK10，该蛋白激酶在盐胁迫等条件下启动，该基因的超量表达使得拟南芥转基因植株表现出更强的抗寒以及抗旱性。Wang等［13］从胡杨中分离出的压力响应基因PeNAC1编码的蛋白在C端有转录激活活性，并得出在干旱和盐胁迫下该基因强烈表达，在PeNAC1过度表达的转基因拟南芥中显示耐盐性增强。Yan等［14］研究表明HSP70和HSP90可改变基因的转录水平；并且胡杨根据接收到的干旱胁迫程度，来激活特定的基因。Zhou等［15］从胡杨中分离出DREB基因，在基因PeDREB2a超表达的转基因拟南芥中，耐盐和耐干旱能力增强。Li等［16］研究得出5个微小RNA是由于脱水引起的。Ma等［17］对胡杨进行耐盐稳定的细胞悬浮培养，发现胡杨的液泡膜对相同的抑制剂如（NEM、DCCD、Nitrate、BafilomycinA1）表现出敏感性。以上研究结果表明，胡杨在一定的盐浓度范围内，有其耐受性，并且其耐盐性并不源于单个基因，而是由多个基因形成的调控网络共同作用完成的［18］。因此，想要解析胡杨的耐盐机理，需要从基因组整体出发，获得与耐盐有关的基因片段并快速测序及鉴定功能 。
本研究利用已构建的胡杨基因组BIBAC（双元细菌人工染色体）文库，结合拟南芥的大片段 DNA 转化技术 ［19］，获得了数个具有抗盐性的突变体，初步研究其耐盐能力并观察和分析其表型变化。另外胡杨基因组序列图谱的破译［20］揭示了胡杨可能的耐盐机制，为解析林木的盐胁迫耐受机理和加速适应盐碱、荒漠地带的林木基因工程育种［21］提供了重要的理论依据。
1材料与方法
1.1实验材料
实验中使用的植物材料拟南芥（Arabidopsis thalia?na）Columbia 野生型植株及转基因T1代和T2代拟南芥植株均在22 ℃，每天16 h光照培养室中培养；所用侵染菌液为根癌农杆菌（保存在-70 ℃冰箱中）。
1.2试验设计
1.2.1转基因植株的获得与检测
以野生型拟南芥生长健壮的苗（始花状态）为转化材料将根癌农杆菌在含50 mg/L卡那霉素和15 mg/L利福平的YEP固体培养基上、28 ℃培养过夜，待单菌落长出后在YEP液体培养基上摇菌培养然后富集菌体使其活化，再将菌液重新悬浮于渗透液中（silwet-77为400 uL/L）。利用花序浸泡的方法转化，拟南芥的花序在渗透液中放置30 s即可，封好保鲜膜以保湿，置于黑暗条件下24 h，然后继续正常培养，待种子成熟后收回种子。
对得到的T1代种子进行卡那霉素平板筛选得到阳性苗，采用酒精消毒法将T1代种子消毒，播种在含有50 mg/L卡纳霉素的1/2 MS固体培养基上，4 ℃春化3 d，培养10 d左右。将抗性幼苗移到培养盆中继续培养，培养过程中进行表型比较观察，成熟后收获T2代种子。
PCR凝胶电泳检测：取拟南芥叶2～3片，采用CTAB法提取DNA，微量紫外分光光度计检测DNA质量。
PCR混合样品制备：10倍Buffer缓冲液2.5 μL，DNA模板1 μL，引物1 μL，dNTP 2.0 μL，DNA聚合酶Taq 0.5 μL，ddH2O 18.0 μL，总体积为25 μL，将样品充分混合并甩至离心管底部。
引物为PTⅡ-R：TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG，NPTⅡ-F：ATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCT。目标片段长度为500 bp。PCR仪反应程序设定为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，设定30个循环；72 ℃继续延伸5 min；反应结束后暂时4 ℃低温保存；1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2阳性转化子的纯合及耐盐性试验
T2纯合系的确定：采用最为原始的方法，播种后观察比较。即对得到的T2代种子消毒后播种于卡那霉素平板上，光照培养箱培养10 d左右观察记录并拍照。
T2代转基因株系的耐盐筛选分析（150 mmol/L NaCl）：将拟南芥转基因株系 T2代种子和野生型种子消毒后播种在盐培养基及对照培养基上。4 ℃ 春化2 d后，移入 22 ℃光照培养箱中培养。培养10 d左右，观察转基因植株和野生型植株的耐盐表型，并拍照记录。耐盐株系从培养皿中移出至营养土中培养并观察表型变化。28 d后，观察耐盐植株与野生型植株的耐盐表型，并拍照记录。
T3代转基因株系的耐盐强度研究（175 mmol/L NaCl）：分别将T3代种子和作为对照的野生型种子（约100粒）消毒后播于培养基上，方法同1.2.2。春化后移入 22 ℃光照培养箱中培养，7 d左右时，进行初步观察，待移苗耐盐筛选。10 d左右时将T3代幼苗及野生型苗同时移至方形培养皿中，竖立培养于22 ℃光照培养架上，观察转基因幼苗和野生型幼苗的长势及根的生长情况，做纵向根培养观察。同时利用上述方法移苗后平放于培养箱中做幼苗植株整体表型观察。35 d左右，观察耐盐植株与野生型植株的耐盐表型，并拍照记录。
1.3指标检测及方法
PCR琼脂糖凝胶电泳检测T2代，然后用紫外成像系统拍照得到电泳结果；对所有收集的各世代转基因种子分别编号并且注明代数，分类后统计得到不同克隆的株系数；对所有转基因T2代进行卡那霉素平板播种，待其长出两片真叶后开始记录，无黄化叶出现的克隆系号则可确定为纯和系，反之则会出现3∶1的分离；对得到的所有纯和系进行耐盐性的初步筛选，设置筛选基质中NaCl浓度为150 mmol/L，每个系号播于带有刻度的方形培养皿中，右边有野生型作为对照，每个系号做2个重复，其中1个用于纵向观察，另1个作为耐盐性初筛的研究。在培养过程中每7 d观察记录1次，得到有一定耐盐能力的克隆。对初步筛选得到的有耐盐能力的T3代在更高NaCl浓度（175 mmol/L）的培养基质上培养，鉴定其耐盐能力。对所有得到的阳性植株播种于营养土中观察表型变化，分别从叶片大小、数量、形状、叶柄长度、抽薹时间、株高、分支数目、有无结实及收获种子数目来确认是否出现表型突变。
1.4数据及照片处理
表格采用Excel 2007处理，图片均采用Abode photoshop CS 处理。
2结果与分析
2.1转化拟南芥的PCR检测
本研究中对521个T2代拟南芥进行PCR检测，采用NPTⅡ基因为引物，目标条带约540 bp，共得到403株阳性植株，电泳部分结果见图1。
由图1可知，P1、P2阳性对照均出现目标条带，N为阴性对照， PCR 结果无目标条带，说明该PCR检测体系可靠，检测结果准确可信。图1共检测了21个株系的拟南芥T2代转化子，其中1，2，4~9，11~19泳道出现目标条带，共17株为阳性。证明目标基因已经整合到了拟南芥基因组中。其余4株为阴性，为非转基因植株，基因组内无目标基因。
2.2拟南芥转化后的统计分析
本实验以胡杨基因随机大片段为转化目标基因，以根癌农杆菌为介导，利用拟南芥作为受体植物进行花序侵染转化。共将1 570个胡杨 BIBAC 克隆进行了拟南芥转化实验，通过对转化后的拟南芥T1种子在含有抗生素的MS平板培养基上进行筛选和 PCR 实验验证，其中590个克隆得到了转基因拟南芥，通过抗盐筛选和表型观察，共得到19个克隆的转基因植株表型异常，见表1。
由表1可以看出，出现表型变化的共有11.02%，数值较高，其中不能稳定遗传的转化子占7.79%，多数可能由于环境因素或插入片段太大等造成。具有初步抗盐能力的转化子占2.89 %，主要是进行了低盐浓度初步筛选，重复试验中抗盐表现尚不稳定，有待进一步确认检验。耐高盐浓度且可重复异常表型的克隆为0.34%，该植株的表型变化经过重复种植，均表现出相同的表型变化。
从生长情况（图2）可以明显地看出转化植物出现表型变化的转基因拟南芥效率非常低，只有0.34%，发生突变原因有待进一步验证。未发生突变的转化子占转基因克隆的绝大部分，这可能是因为所插入的外源基因片段太大，并没有使得外源基因在拟南芥中表达所造成的；但是实验中也得到了可以稳定表达的表型特异阳性转基因拟南芥，说明本研究利用构建胡杨BIBAC ［20］文库的方法建立胡杨转化基因组学的研究方法可行。
2.3转基因拟南芥的耐盐筛选
实验对所得到的转基因T2代共590个克隆经卡那霉素筛选后移至含150 mmol/L NaCl的MS培养基上培养，得到147个可以抗盐的克隆，为进一步鉴定确认，将筛出的有耐盐能力的植株对照编号找出它们的T2代种子，继续在150 mmol/L NaCl的MS培养基上培养，其中有10个株系与上一次的筛选结果一致，确认了抗盐分析结果，排除了环境对生长的影响。
确认得到的10个克隆为转入的基因改变了拟南芥对盐的抵抗能力。图2中A、B、C、D为两个耐盐能力较强的耐盐株系，E、F为更高浓度（175 mmol/L NaCl）处理下T3代的耐盐性研究，其耐盐表现见图2。
图2中A、B、C、D 4张图分别是同一个转基因克隆的T2代2个不同株系，在培养至45 d时观察，由图2A可知，左侧3株的转基因株系长势要明显好于右侧3株的野生型株系，呈现耐盐表型；图2B中左侧2株为转基因株系，可以克服高盐环境正常生长；右侧3株为野生型，在生长初期长势较弱，14 d以后逐渐白化死亡，图2B、D分别是图2A、C生长后期的图片，说明此转基因株系转入了与盐胁迫响应相关的基因。
图2E、F为另一个转基因克隆的T3代株系，该株系与野生型在含175 mmol/L的NaCl培养基上培养28 d时观察比较。由图可知，左侧的转基因拟南芥在高盐浓度培养基上，仍然可以正常生长，主根长达1.5 cm左右，侧根数量较多，根以上部分长势较好，真叶数量均为8片；而右侧的野生型拟南芥则已经白化死亡，图2F是E图生长后期，由此可见该株系拟南芥具有较好的耐盐表现。
2.4拟南芥T3代的表型变化
对得到的纯合转基因拟南芥进行营养土播种实验时发现了两个形态表型明显变化的突变系（图3）。图3所示，与野生型图3A相比较，图3B中的突变体在生长早期表现为叶片嫩绿色，叶片呈圆形，表面凸凹不平，有褶皱，叶缘向下翻卷但叶片中部向上翻起，莲座叶和茎生叶都变得肥大，而且叶片无锯齿；而野生型叶片呈倒卵或者匙形，有锯齿，表面无褶皱。图3D为该突变体生长后期，与野生型（图3C）相比，该突变体花茎抽薹要晚于野生型，花序紧凑。 图3E、 F为筛选中发现的另一个突变系，该突变系叶片呈深绿色、较野生型细长，没有表皮毛；叶柄短，株型紧凑，生长速度较野生型慢，营养生育期较长，抽薹后植株较矮，节间距明显缩短，株型变小，整株植株的高度约为10 cm左右，子代虽能正常开花，但花期比正常的花期推后15 d左右，并出现败育，不能正常结种。
这两个突变系的出现，可能是由于外源基因的作用导致，即插入的胡杨外源基因导致表型出现变化；也可能是由于外源基因的插入导致内部基因突变所致，究竟是哪种原因，还有待于进一步分析研究。
3结论与讨论
本研究得到有形态表型变化的转基因株系和耐盐能力明显强于野生型的转基因拟南芥，此结果表明，利用胡杨基因组大片段转化拟南芥，可获得耐盐株系及表型变化株系，后续排除外界影响经反复试验证明其确实发生表型突变。此结果很有可能是胡杨的相关基因簇在拟南芥中表达所致，这和本实验的设计方案和预期目标吻合，表明该研究体系切实可行，为挖掘胡杨耐盐基因以及进行胡杨功能基因验证奠定了基础。
对转基因拟南芥进行耐盐分析中发现了17个株系可以在NaCl胁迫下生长，而作为对照的野生型从萌发期到苗期的生长均滞后于转化植株，且随着时间的延长差别愈来愈大，最终野生型由于不耐盐而停止生长，表明这些株系具备初步耐盐能力。分析原因，可能是插入的外源胡杨大片段基因携带耐盐基因所致，也有可能是外源基因片段插入位点的拟南芥自身基因被破坏或激活而造成，还可能是由于环境因素及拟南芥自身差异的影响，上述因素均有可能造成拟南芥植株生长异常。Zhou等［15］的研究结果表明PeDREB2a基因编码转录激活剂，PeDREB2a基因超表达的拟南芥可以在盐胁迫下正常生长，且此转基因拟南芥还表现出抗干旱能力，所以从胡杨中分离出可提高植物耐盐能力的基因就有了科学支撑。本研究借鉴前人的方法及经验，利用胡杨基因组大片段进行转化［20］，内部有可能携带着胡杨基因组内抗逆相关的基因簇，该耐盐表型更有可能是由于转入胡杨基因片段太大，无法将此结果确定为获得的耐盐性是由于单基因转入拟南芥后表达的结果，因此研究中进一步进行耐盐筛选，并多次重复，发现2个转化株系具有较好的耐盐能力且能够稳定遗传，除了能够在盐胁迫下生存以外，还出现了比在基础培养基上生长更好的结果，说明该转化子成功转入了与耐盐有关的基因（簇），它可以在拟南芥中稳定遗传，并且表现出了对盐胁迫的适应性，而其他转基因株系的耐盐表现并不稳定。这个结果的出现可能是由于在转基因后代中有些外源基因插入能稳定遗传，而有些插入的外源基因在后代中丢失或发生基因沉默，而导致耐盐性状不稳定。
本研究还获得了2个株型发生明显变化的突变系。植物株型的形成受多种因素的影响，其中主要的影响因素有基因表达、激素水平、环境条件等［22］，环境因素是影响植物株型的形成因素之一，植物光周期及生长温度的发生变化，会导致植物农艺性状发生改变。本研究采取一定的措施尽量排除环境对株型的影响，在寻找突变体时，主要从叶片表型如大小、数目、形状、颜色深浅，有无表皮毛、叶柄长短、花序紧凑程度等肉眼较容易观察到的指标进行判断，然后对其可能有突变的植株跟踪观察，对后续的植株抽薹时间、花盘大小、分支数、株高及开花时间、有无结实和种子数量进行综合分析，在后续实验中，需要从以上各因素统计并分析，有报道称在PeDREB2a过度表达的拟南芥中根长和株高都有显著增长趋势［15］。植物表型变化还有基因水平的影响，拟南芥REV蛋白属于HD-ZIPⅢ［23］家族，HD-ZIPⅢ中有多种蛋白与植株株型的形成有关，其中REV有潜在的调控叶片极性发育和调控茎分生组织形成的特性［24］。
本研究通过筛选分析胡杨大片段转化到拟南芥中所产生的耐盐能力及形态表型变化，从而挖掘潜在的胡杨耐盐功能基因。因此，下一步研究工作将结合表型变化和耐盐做进一步的分析研究并对插入的胡杨大片段进行测序分析，利用生物信息学手段分析胡杨大片段中可能存在的耐盐基因，同时，利用Hi-Tail PCR方法分析外源基因插入的拟南芥基因位点，来分析该耐盐表型能力是外源基因造成还是内源基因被插入突变而导致。利用以上方法，排除相关影响及干扰，可以初步筛选并鉴定出胡杨耐盐基因资源。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献
［1］Pruitt R E，Meyerowitz E M. Characterization of the genome of Arabidopsis thaliana［J］.Journal of Molecular Biology，1986，187（2）：169-183.
［2］KatoT，Asamizu E，NakamuraY，et al.Genome analysis of a flowering plant，Arabidopsis thaliana brassicas and legumes from genome structure to breeding［J］.Biotechnology in Agriculture and Forestry，2003，52：4-18.
［3］Bechtold N，Ellis J，Pelletier.In plant Agro?bacterium?mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants［J］.Life sciences，1993，316：194-199.
［4］吴平，赵健，王文丽，等.额济纳绿洲胡杨生物生态学特性的调查［J］.内蒙古草业，2005，17（3）：4-6， 13.
［5］Li B，Yin W，Xia X.Identification of microRNAs and their targets from Populus euphratica［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2009，388（2）：272-277.
［6］卢孟柱，胡建军.我国转基因杨树的研究及应用现状［J］.林业科技开发，2006，20（6）：1-4.
［7］曾凡江，宋轩.策勒绿洲4种杨树的生理生态学特性的研究——P-V曲线和持水力的研究［J］.辽宁林业科技，2000（5）：29-31， 41.
［8］樊军锋，韩一凡，李玲，等.84K杨树耐盐基因转化研究［J］.西北林学院学报，2002，17（4）：33-37.
［9］马焕成，王沙生.盐胁迫下胡杨的离子响应［J］.西南林学院学报，1998（1）：43-48.
［10］马焕成，王沙生.胡杨膜系统的盐稳定性及盐胁迫下的代谢调节［J］.西南林学院学报，1998（1）：16-24.
［11］马挺军，向远寅，王沙生.盐胁迫对胡杨液泡膜H+ATPase水解活性的影响［J］.新疆农业大学学报，2003，26（2）：43-48.
［12］Chen J，Xue B，Xia X，et al.A novel calcium?dependent protein kinase gene from Populus euphratica， confers both drought and cold stress tolerance［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2013，441（3）：630-636.
［13］Wang J Y，Wang J P.A populus euphratica NAC protein regulating Na+/K+ homeostasis improves salt tolerance in Arabidopsis thaliana［J］.Gene，2013，521（2）：265-273.
［14］Yan D H，Fenning T，Tang S，et al.Genome?wide transcriptional response of Populus euphratica to long?term drought stress［J］.Plant Science，2012，195：24-35.
［15］Zhou M L，Ma J T，Zhao Y M，et al. Improvement of drought and salt tolerance in Arabidopsis and Lotus corniculatus by overexpression of a novel DREB transcription factor from Populus euphratica［J］.Gene，2012，506（1）：10-17.
［16］Li B S，Yin W L，Xin X L，et al.Indentification of micro RNAs and their targets from Popnlus euphratica［J］.Biochemical and Biophysical Researh Communications，2009，388（2）：272-277.
［17］Ma T J，Liu Q L，Li Z H，et al.Tonoplast H+-ATPase in response to salt stress in Populus euphratica cell suspensions［J］.Plant Science，2002，1630（3）：499-505.
［18］Chen S，Polle A.Salinity tolerance of Populus［J］.Plant Biology （Stuttgart， Germany），2010，12（2）：317-333.
［19］周婧.利用BIBAC文库建立胡杨转化基因组学平台及鉴定胡杨耐盐基因（簇）的研究［D］.北京：中国林业科学研究院，2013：60-67.
［20］Tuskan G S， Difazio S ，Jansson J，et al.The genome of black cottonwood，Populous trichocarpa（Torr.&gray）［J］.Science，2006，313（5793）：1596-1604.
［21］王敏杰，卢孟柱.林木基因工程育种现状与发展趋势［J］.世界林业研究，2002，15（3）：7-13.
［22］史伟杰，刘建伟，张彦峰，等.拟南芥株型突变体zpr1的性状特征与基因鉴定分析［J］.西北植物学报，2014，34（11）：2153-2158.
［23］Prigge M J，Otsuga D，Alonso J M，et al.Class III homeodomain?leucine zipper gene family members have overlapping， antagonistic， and distinct roles in Arabidopsis development［J］.The Plant Cell，2005，17（1）：61-76.
［24］Talbert P B，Adler H T，Parks D W，et al.The REVOLUTA gene is necessary for apical meristem development and for limiting cell divisions in the leaves and stems of Arabidopsis thaliana［J］.Development，1995，121（9）：2723-2735.
（责任编辑 吴祝华）