马瑞欣1,2，苏欢欢2，梁艳红2，孙伟彬2，3，安志业3，张勇1
（1.河北省水产养殖病害防治监测总站，石家庄 050011；
2.河北省水产品质量检验检测站， 石家庄 050035；3.河北省水产技术推广站，石家庄 050011）
石油是一种成份复杂的混合物，主要包括饱和烃、芳香烃类化合物、沥青、树脂类等。随着石油工业的发展，石油烃已成为造成海洋污染的主要物质之一，特别是其中的芳香烃类化合物是对水生生物构成危害的主要部分。水中的石油烃能被吸附于水体中的悬浮颗粒和胶体颗粒，鱼类通过体肤渗透、呼吸代谢蓄积在体内，造成鱼类体型弯曲畸形，影响鱼类的生长繁殖。双壳贝类由于从水中摄食悬浮颗粒和胶体颗粒，对石油烃的富集能力很强，石油烃可抑制双壳类的免疫力，增强疾病的易感性；水中的石油烃被鱼贝富集后，通过食物链危害人体健康。目前生物体内的石油烃测定方法主要有紫外法[1]、荧光分光光度法[2-5]。GB17378.6-2007中石油烃的测定采用荧光分光光度法，但该方法检测批量样品时，可操作性差。因此本文对实验条件进行了研究和改进，以适用于批量样品的检测，并对实验应注意的问题进行了总结。
1材料与方法
1.1仪器与设备
荧光分光光度计（日本日立，F-7000）、 涡旋混合振荡器（Ms3，广州仪科）、数显恒温振荡器（上海梅香，SHY-2）、千分之一电子天平（赛多利斯CP323S）、 万分之一电子天平（赛多利斯，BT224S）、超纯水仪（millipore）、离心机（湖南湘仪，TDZ5-WS）。
1.2主要试剂与材料
脱芳石油醚（色谱纯或分光纯，沸点60～90 ℃）；无水乙醇（色谱纯）；氢氧化钠（优级纯），氯化钠（优级纯），二氯甲烷（色谱纯）；
标准贮备溶液：购自国家海洋环境监测中心，浓度1 000 μg/mL，采用20号重柴油和润滑油为原料配制而成。
实验所用水为超纯水。
2实验方法
2.1样品预处理
贝类：用蒸馏水洗净贝壳外部附着物，取软体组织和体液匀浆后放入磨口玻璃瓶中，-20 ℃保存备用。
鱼类、虾类等取可食部分匀浆，放入磨口玻璃瓶中，-20 ℃保存备用。
2.2样品前处理
称取样品2～5 g于100 mL皂化瓶中，加入20 mL 6 mol/L氢氧化钠溶液，涡旋混合均匀，放入35 ℃恒温水浴振荡器中避光振荡11 h，加入20 mL 无水乙醇，涡旋振荡，放置4 h后，转入250 mL分液漏斗中，用10 mL二氯甲烷洗涤皂化瓶，洗涤液转入250 mL分液漏斗中，加入30 mL饱和氯化钠溶液、100 mL水，充分振荡，静止分层，下层放入100 mL鸡心瓶中，再用10 mL二氯甲烷洗涤皂化瓶后转移到250 mL分液漏斗中进行萃取，萃取液合并到100 mL鸡心瓶中，40 ℃旋转蒸发至干，准确加入10.0 mL石油醚定容，涡旋混匀30 s,转移到10 mL玻璃试管中，4 000 r/min 离心5 min，上清液供荧光分光光度计测试使用。
2.3标准系列
取贮备液用石油醚稀释成100 μg/mL的使用液，分别取0 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.0 mL置于皂化瓶中，处理过程同2.2。
2.4干湿比的测定
在干燥恒重的称量瓶中称取5～10 g样品，记录湿重，放置于105 ℃烘箱中24 h，干燥器中冷却后，恒重，记录干重，计算干湿比。
2.5仪器条件
激发波长310 nm，发射波长360 nm，负高压150。
3实验结果
3.1线性
石油烃在0～10.0 μg/mL浓度范围内线性良好，线性系数R≥0.995。
3.2准确度和精密度
在鱼虾等本底低的样品中进行标准溶液的添加，添加水平分成25 μg、50 μg、75 μg三个水平，每个添加水平做6个平行。测定结果见表1。
4讨论
4.1碱解条件
实验比较了两种条件下的碱解结果，（1）35 ℃恒温水浴振荡11 h；（2）35 ℃烘箱中放置11 h，每隔1 h 涡旋振荡60 min。实验发现，两种情况下的标准工作曲线的线性、回收率和相对标准偏差相差无几，但由于烘箱水解每隔1 h涡旋振荡一次，比较浪费人力，因此选用35 ℃恒温水浴振荡碱解条件。
4.2本方法相对于GB17378.6-2007中的石油烃测定做了以下改进
碱解温度由室温、每隔1 h振荡一次，改为35 ℃恒温水浴振荡，避免了温度变化的影响，同时节省了人力。
由50 ℃旋转蒸发浓缩萃取液后再氮吹至干改为40 ℃旋转蒸发至干，缩短了操作时间，增强了方法的可操作性。
由于定容后的溶液不一定澄清，定容后增加了离心过程。
4.3实验中应注意的问题
样品的制备过程中避免接触塑料器具，尤其是对于定容后的浑浊溶液，应离心而不能用过滤膜。
样品称量时注意不要沾到皂化瓶口，否则会造成碱解不完全。
样品的均匀性对数据的影响非常大，由于鱼贝的不同部位富集石油烃的能力不同[6]，因此样品预处理和称样时均要注意保证样品的均匀性。
石油醚、无水乙醇、二氯甲烷的荧光强度：本实验选用了色谱纯或分光纯的试剂，其荧光强度在360 nm处无吸收，对检测结果不会造成影响。
所用分液漏斗为聚四氟乙烯活塞，不能使用涂抹了凡士林的磨口塞分液漏斗。
5结论
应用该法检测贝类中的石油烃含量，有的样品最终得到的上机液中会出现凝胶状物质，造成测定结果不准确；鱼虾检测的最终上机溶液澄清，回收率好。因此该法不完全适用于贝类等物质中石油烃的测定，但能很好地应用于鱼虾中石油烃的检测。
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参考文献：
[1]
尚龙生，孙茜，徐恒振，等.紫外分光光度法测定贻贝体内石油烃的方法研究[J].海洋环境科学,1998,17(1):62-65
[2] 贾小平，林钦，吕晓瑜，等.荧光分光光度法测定海洋贝类总石油烃的方法研究[J].湛江海洋大学学报，1999，119(4): 30-35
[3] 尚龙生，许乙烈，马永安，等.荧光分光光度法测定海藻中的石油烃[J].分析化学研究简报，1997，25: 205-207
[4] GB17378.6-2007，海洋生物监测[s] 第6部分：生物体分析.北京：中国标准出版社，2008
[5] 张海燕，周德庆.荧光分光光度法测定水产品中石油烃的方法研究[J].海洋水产研究，2008，29(4):106-111
[6] 杨广杏，万军明，麦志勤.鱼类石油烃污染剖析[J].环境与开发，1995，10(3):25-26