饶恩铭 RAO En-ming；刘涛 LIU Tao；次仁德吉Cirendeji；宋博文 SONG Bo-wen
（西藏大学农牧学院，林芝 860000）
（Agricultural and Animal Husbandry College of Tibet University，Linzhi 860000，China）
摘要：为了解西藏人工栽培灵芝的主要活性成分，采集当地栽培的灵芝为原材料，分别采用蒽酮-硫酸分光法、紫外分光光度法、柱前衍生化RP-HPLC方法，分析其主要活性成分。结果表明，西藏人工栽培的灵芝中灵芝多糖、三萜类、氨基酸含量依次为：1.199g/100g、1.63%、8.898g/100g，经与国内报道相比较，西藏人工灵芝活性成分比较丰富，氨基酸和三萜类含量高于其他区域。
Abstract： In order to understand the main active ingredient in Tibet cultivated Ganoderma Lucidum， this article collected the local cultivated Ganoderma Lucidum as the raw materials， used anthrone-sulfuric acid spectroscopy， spectrophotometry， pre-column derivatization RP-HPLC method to analyze the main active ingredient. The results showed that the contents of Ganoderma lucidum polysaccharides， triterpenoids， amino acids in Tibet cultivated Ganoderma Lucidum were： 1.199g/100g， 1.63%， 8.898g/100g. Compared with national coverage， the active ingredient of cultivated Ganoderma Lucidum is richer， and the acid and triterpenoids content is higher than that in other regions.
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关键词 ：西藏；灵芝；活性成分；分析
Key words： Tibet；Ganoderma Lucidum；active ingredient；analysis
中图分类号：S567.3+1文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2015）25-0195-04
作者简介：饶恩铭（1992-），男，四川巴中人，西藏大学农牧学院，本科，研究方向为应用化学。
0 引言
灵芝（Ganoderma Lucidum）为多孔菌科真菌灵芝的子实体，外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形，广泛分布于多个省区，主要寄生在栎树及其它阔叶树木桩上[1]。我国古代历来将灵芝称做仙草、瑞草和吉祥草，甚至称为“长生不老药”，几千年来在中国形成了源远流长的中国灵芝文化[2]。中华传统医学一直视其为延年益寿、扶正固本、滋补强壮的珍贵中草药，几千年来倍受中华民族的珍爱和崇拜。《中国药典》（2010年版）中，药理研究表明对风湿、哮喘、冠心病、肿瘤、心绞痛、高血压病、肝炎、白细胞减少症、慢性支气管炎、神经衰弱等具有很好的疗效[3]。现代医学也证明，灵芝中含有：蛋白质类、三萜类、多糖类、油脂类、甾醇类、氨基酸类、微量元素等[2]，其中灵芝三萜类、氨基酸及多糖类为灵芝的主要药理活性成分。
由于灵芝的众多功效已经得到证实，其价值也越来越高，所以近些年来，许多地方已经开始人工栽培。西藏东南部地区受印度洋及孟加拉湾强湿暖气流的影响形成了复杂多样的地理地貌及植被类型，在林下分布着较为广泛的野生灵芝，因此西藏林芝被称为“灵芝之乡”[1]。有关西藏灵芝的报道多集中在野生灵芝多糖的提取、品质对比等方面，而对西藏人工栽培灵芝的活性成分方面研究还未见报道。本实验采用标准分析手段，对西藏人工栽培灵芝的主要活性成分进行测定，为更好地开发利用西藏灵芝资源提供依据。
1 材料和方法
1.1 材料
十月份，在西藏林芝地区两处种植基地（百巴镇、八一镇）购买完整灵芝，分别编号1、3、5、和2、4、6。流水洗净外表后，于60℃干燥箱中干燥48小时，然后用粉碎机依次将样品粉碎并装入袋中存于干燥器内备用。
1.2 测定方法
1.2.1 灵芝多糖的测定
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参考文献4中硫酸—蒽酮法。
1.2.1.1 供试品溶液制备
精密称取待测样品2.0000g置放于100ml圆底烧瓶内，加水70ml后放于沸水浴中加热50min，冷却至室温后定容到100ml容量瓶中，摇匀后立即过滤，除去初滤液后保存余下溶液。精确吸取滤液10.00ml，放置50mL离心管中，加30mL无水乙醇溶解后，振荡摇匀，于冰箱保鲜室（0～5℃）内静置12小时，离心除去上层溶液，沉淀再用80%乙醇洗涤2～3次。最后沉淀用1ml10%的硫酸溶液溶解后转移到50ml容量瓶中，加水定容，振荡摇匀待测。
1.2.1.2 标准曲线
精确吸取0.1mg/ml的葡聚糖水标准溶液0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml于10ml容量瓶中，加入6mL硫酸-蒽酮溶液，混匀后在沸水浴中加热10min，冷却至室温定容。用UV-752N紫外可见分光光度计于500～700nm波长范围进行光谱扫描，最后选择625nm为测定波长，分别测定上述溶液，得到标准曲线回归方程为：
C=0.1597A+0.0102 （r=0.9999）
式中：C为样品浓度，A为吸光度。相关系数R达到0.9999，说明葡聚糖浓度在0.005～0.10mg/ml范围内与吸光度呈现很好的线性关系。
1.2.1.3 精密度检测
精确吸取0.40ml葡聚糖标准溶液，按照上述方法平行测定5次，结果平均值为0.4002，数据标准偏差为0.0004，精度为99.995%，表明该方法精密度很好。
1.2.1.4 重现性检测
精确吸取任意待测样品5份，按上述方法进行吸光度测试，数据标准偏差为0.0075，说明该方法用于灵芝水溶性多糖测定重现性良好，方法可行。
1.2.2 灵芝三萜类的测定
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参考文献5中介绍的紫外分光光度法。
1.2.2.1 标准溶液配制
称取灵芝酸标准品（购买）精确配制0.54mg/ml灵芝酸（C2）标准溶液10ml（以饱和NaHCO3溶液溶解，定容稀释）。
1.2.2.2 供试品溶液制备取样品粉末，并称取样品1.00g，加入50ml氯仿溶液溶解，用超声提取器提取30min，将样品过滤后，滤液用氯仿定容至50ml容量瓶中。准确吸取氯仿容液10ml，用饱和10mlNaHCO3溶液在分液漏斗中萃取4次，收集萃取液，用饱和NaHCO3溶液定容于50ml容量瓶中，作为实验试品溶液。
1.2.2.3 方法可行性考察
取1.2.2.1、1.2.2.2溶液，在200～400nm波长下进行紫外扫描，结果发现标准液和样品液紫外图谱基本一致，260nm为最大吸收波长。故确定以饱和NaHCO3溶液为溶剂，测定波长确定为260nm。
1.2.2.4 标准曲线制备
精密吸取标准品溶液0.2ml、0.4ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml（0.54mg·ml-1）置于6个10ml量瓶中，用NaHCO3饱和溶液加至刻度线，测定吸收值，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果得出标准样品在0.008～0.0486mg·ml-1范围内具有很好的线性关系，线性回归方程为：
Y=14.129X+0.0171，R=0.9997
1.2.3 人工栽培灵芝氨基酸分析测定[6]
采用文献6中柱前衍生化RP-HPLC方法。
1.2.3.1 溶液的配制
标准氨基酸混合液：按照天冬氨酸、脯氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、亮氨酸、丙氨酸、胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸的浓度为2.5mmol/L，除胱氨酸浓度为1.25mmol/L配制混合溶液。
供试品溶液：准确称取1g灵芝粉末放水解管内水解，加15ml 6mol/L盐酸，加入少量新制的苯酚，将体系抽成真空充入高纯氮气，重复3-4次。快速将已充好氮气的水解管盖子盖好，放入烘箱中（110℃）水解约22h。水解完成后，将水解液过滤定容。取适量于55℃减压干燥至干，再用适量二次蒸馏水复溶待用。
1.2.3.2 衍生化反应
精密量取氨基酸对照品和样品溶液各200ul，加13.5%三乙胺乙腈溶液100ul，混合均匀，加入含1.2% PITC乙腈溶液100ul，室温静置1h，加入0.8ml正己烷萃取，剧烈振摇3min，静置约10min，取下层溶液真空干燥后，加400ul乙腈复溶，0.22um滤膜过滤后备用。
1.2.3.3 色谱条件[6]
色谱柱C18柱（250mm*4.6mm，5um），流动相A：0.1mol/L醋酸钠溶液-乙腈（97：3），流动相B：乙腈-水（8：2），洗脱梯度见表1流速1ml/min，温度40℃，检测波长254nm，进样体积2uL[8]。洗脱梯度见表1。
1.2.3.4 标准曲线
取标准混合溶液200ul，按1.2.3.2衍生化后进行测定，以峰面积A为纵坐标，氨基酸c（ug/ml）为横坐标，制作标准曲线，得回归方程，结果如表2。结果表明，十七种氨基酸线性关系良好，可用外标法进行测定。
1.2.3.5 精密度、重现性试验
取氨基酸标准液，连续进样5次并记录色谱图，十七种氨基酸的峰面积相对标准偏差（RSD）在3.48%~1.07%之间，可满足分析实验要求。
取同一份样品溶液5份，按1.2.3.2项下方法衍生化后测定，十七种氨基酸的峰面积相对标准偏差（RSD）在4.04%~1.44%之间，表明该方法重现性较好。
2 结果与分析
2.1 西藏人工栽培灵芝多糖含量
按照1.2方法依次测定六个样品，测定结果如表3。
韩建军[7]在文献中提到在灵芝中已经分离到200多种多糖物质，大多为β-型结构，少数为α-型结构，而一般β-构型为有效活性成分，由此可见灵芝中多糖的含量是非常丰富的，也是灵芝有效的成分之一。从表1可以看出，西藏人工栽培的灵芝中多糖含量在1.032～1.371g/100g之间，平均值为1.199g/100g，对比福建野生灵芝中1.096/100g多糖含量稍高，西藏人工栽培的灵芝中灵芝多糖含量中等。
本次实验采用了硫酸-蒽酮法测定多糖，文献记载较苯酚-硫酸法线性关系更好[5]，多糖测定方法还需进一步研究。本实验在置于沸水浴中加热时时间需严格控制，以免影响测定结果误差，最后测得西藏本地栽培灵芝多糖含量1.199%，参考数据接近。对于西藏本地灵芝文化的发展奠定了基础。
2.2 西藏人工栽培灵芝三萜类物质含量
取6组灵芝粉末干样品，按1.2.2.2方法分别制备待试样品溶液，然后依次在260nm测定吸光度，最后计算各样品种三萜类含量。结果见表4。
三萜类化合物是灵芝的主要活性成分之一，大部分为30个碳原子，少部分为27个碳原子萜类，本实验采用了一种快速灵芝检测方法[5]，以灵芝酸C2（C30H46O7）为对照品，因此本实验只会检测出C30类三萜化合物，无法检测出少部分C27三萜化合物，则实际的三萜类化合物要高于本实验测出1.63%，而本实验结果高于黄书铭山东泰安灵芝三萜类1.48%，说明西藏地区的人工培养灵芝三萜类含量具有更高开发价值，三萜类含量测定有待进一步改进研究方法。本实验中我们选择以NaHCO3为溶剂，同样NaHCO3溶液为空白对照样，用了紫外分光光度法测定了三萜物质的含量，结果可靠，为林芝地区灵芝在三萜类开发方面提供了很大的科学依据。
2.3 西藏栽培灵芝氨基酸的含量
将6组样品按照上述处理方法处理后，用HPLC（岛津LC-20A）在进行测定如表5。
在对西藏灵芝的氨基酸分析中，本实验通过酸水解，采用柱前衍生高效液相色谱，最终测出了16种氨基酸，西藏栽培灵芝氨基酸总含量大在8.898g/100g，高于国内相关报道[10]，并且必需氨基酸总量和全氨基酸量均高于国内报道，但测出的必须氨基酸占总氨基酸的量的39%。本次高效液相色谱测氨基酸采用了酸水解灵芝干样品，色氨酸分子结构在酸水解中被破坏，[8]需要碱水解方能测出，色氨酸量需要进一步研究，本实验得出了西藏灵芝含有16种氨基酸，包括7种必须氨基酸，实验未能检出胱氨酸，有待进一步研究。
此实验得出，样品4的氨基酸含量远高于其他几个样品中氨基酸的含量，是否是取灵芝粉末样品时，主要取到了灵芝的某一部位。是否灵芝不同部位的氨基酸含量有差异需要进一步研究。
3 结论
本实验采用了西藏林芝栽培灵芝为实验材料，共采用了6组样品做实验，分别采自林芝八一和百巴镇养殖户，最后得出：八一镇和百巴镇的灵芝多糖含量接近，三萜类含量八一镇多于百巴镇，氨基酸含量百巴镇多于八一镇，可能和地域和养殖方法有关。西藏林芝地区的灵芝的粗多糖含量和国内文献报道相近，为1.195%，灵芝中的三萜类（灵芝酸）为1.63%，高出了国内1.48%相关报道[9]。在氨基酸含量方面，本次实验测出了16种氨基酸，7种必须氨基酸，总氨基酸量达到8.898g/100g。最后得出林芝地区栽培灵芝营养丰富，特别是三萜类、氨基酸类物质含量丰富，可作为西藏当地经济作物推广、食品保健等开发奠定基础。
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