焦 铭，孙 雪，李 笔，黄俊潮
（湖北科技学院基础医学院，湖北 咸宁 ４３７１００）
摘要：通过对斑马鱼肌肉注射不同浓度毒死蜱以及维生素Ｅ，研究斑马鱼血清中过氧化氢酶（ＣＡＴ）和超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活力变化情况以及维生素Ｅ的抗氧化作用。试验分为５组，依次为对照组和低、中、高浓度毒死蜱组（０．００２、０．０２、０．２ ｍｇ／ｋｇ）以及高浓度联合维生素Ｅ（０．２ ｍｇ／ｋｇ＋ＶＥ）治疗组。结果表明，毒死蜱不同浓度组短时间（２４ ｈ）作用均使两种酶活性升高（P﹤０．０１），加维生素Ｅ组活性增高更显著；长时间（１６８ ｈ）作用则明显抑制酶活性（P﹤０．０１），维生素Ｅ组酶活性变化较平缓。表明毒死蜱对斑马鱼机体抗氧化系统损伤作用明显，维生素Ｅ对ＣＡＴ和ＳＯＤ活力有保护作用。
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关键词 ：维生素Ｅ；毒死蜱；斑马鱼；过氧化氢酶；超氧化物歧化酶
中图分类号：Ｘ５９２ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）07－1590-03
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.014
毒死蜱（Ｃｈｌｏｒｐｙｒｉｆｏｓ）商品名为乐斯本，具有触杀、胃毒和熏蒸作用，凭借其高效、低毒、广谱的特性成为全球应用最为广泛的农药之一［１］。毒死蜱主要通过干扰胆碱酯酶的活性，从而影响人类和昆虫的中枢神经系统［２］。毒死蜱类有机磷农药对哺乳动物的毒性较低，但对水生鱼类的毒性却比较高，若使用不当进入水环境，将对水生生态和水产养殖带来比较大的危害［３］。由于毒死蜱的大量使用，在较多地区的土壤、大气、雨水和地下水等均能检测到毒死蜱残留，水体也由于毒死蜱污染累积导致鱼类死亡。农药对环境产生的危害最终会通过富集浓缩和食物链传递给人类［４］。因此，研究毒死蜱的毒理作用将可为农药安全使用，水产资源和生态环境保护提供理论依据。
外源毒物通过各种途径进入生物机体后，感染机体会出现各种生物标记物的改变，这种生物标记物常用来评估受试化学品对生物的生态毒理效应［５］，过氧化氢酶（ＣＡＴ）和超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）是生物标记物中最典型的两种酶。ＣＡＴ和ＳＯＤ是体内清除自由基的抗氧化酶，它们之间通过协同作用能够防止自由基对细胞结构的损伤［６］。环境污染物质对水生生物会造成过氧化胁迫，使生物体内产生大量自由基［７］，ＳＯＤ能催化歧化体内超氧阴离子自由基为过氧化氢（Ｈ２Ｏ２），ＣＡＴ催化Ｈ２Ｏ２分解为Ｈ２Ｏ和Ｏ２。通过ＣＡＴ和ＳＯＤ调节体内的氧自由基处于平衡的状态，一旦机体受到毒理损伤，这种平衡就会被打破，因而ＣＡＴ和ＳＯＤ作为抗氧化防御系统的改变就能反映环境对机体的毒害作用。本试验研究了毒死蜱对斑马鱼血清中ＣＡＴ和ＳＯＤ的影响，以衡量农药对水产环境及水生生物的生态毒理指标。
维生素Ｅ有许多生理功能，其中最重要的功能就是抗氧化。维生素Ｅ能有效防止机体脂质过氧化及由于外因所致的氧化，保护细胞骨架、蛋白质巯基，维持细胞膜的正常功能，尤其是保护亚细胞膜的完整性，避免受到过氧化物损害［８］。另外维生素Ｅ还能防治由氧化应激导致的心血管疾病、动脉粥样硬化和癌症等［９］。本研究表明维生素Ｅ能够有效保护ＣＡＴ和ＳＯＤ在斑马鱼血清中的活性，减轻毒死蜱对机体造成的过氧化胁迫。
１ 材料与方法
１．１ 材料
斑马鱼由中国科学院水生生物研究所提供，平均体长２～３ ｃｍ。试验前在室内驯养７ ｄ以上，自然死亡率小于２％，试验前１天停止喂食，试验期间每４８ ｈ定量喂食１次。
１．２ 试剂与仪器
毒死蜱原药（９８％，安徽华星化工股份有限公司），用无菌生理盐水配成不同浓度溶液待用。其他试剂均为国产分析纯。仪器为ＵＶ－２５５０型紫外－可见分光光度计（岛津制作所）。
１．３ 方法
１．３．１ 试验设计和染毒 试验共分５组，分别为阴性对照组、低中高３个浓度梯度试验组和１个高浓度联合维生素Ｅ组。根据急性毒性试验结果，以０．００２、０．０２、０．２ ｍｇ／ｋｇ剂量对斑马鱼进行肌肉注射，每组２５尾鱼，每尾注射１ ｍＬ毒死蜱溶液，分别于容积１０ Ｌ塑料箱中装水饲养。维生素Ｅ剂量为１００ ｍｇ／ｋｇ，稀释液现配现用，使用时在旋涡混悬仪上充分混匀。试验用水为曝气去氯处理２４ ｈ后的自来水，水温１７～２０ ℃，ｐＨ为６．８～７．５，水中溶氧量保证５ ｍｇ／Ｌ以上。按预定时间段０、２４、４８、９６、１６８ ｈ时分别取鱼采样进行分析，每组浓度每次取样５尾。
１．３．２ 取血采样 采样之前，先用１％肝素钠处理注射器，于鱼尾采血，直接放入干净试管中以制备血清，对血清ＣＡＴ和ＳＯＤ活性进行测定。
１．３．３ 酶活力测定方法 ＣＡＴ活性测定采用Ｇóｔｈ［１０］的方法，以Ｈ２Ｏ２为底物，经ＣＡＴ在３７ ℃催化反应１ ｍｉｎ后，用钼酸铵终止反应，在２５ ℃放置５ ｍｉｎ，由于反应后剩余的过氧化氢能与钼酸铵形成稳定的黄色复合物，其颜色的深浅与酶活力成反比，因此在４０５ ｎｍ处测量该黄色复合物的生成量，即可计算出ＣＡＴ的活力。
ＳＯＤ活性测定采用经典的邻苯三酚自氧化抑制法［１１］。邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，生成一系列有强烈光吸收的中间产物，并同时释放出Ｏ２-，该反应生成的中间产物在紫外３２０ ｎｍ处的光吸收值在最初５ min内呈线性关系，而ＳＯＤ是专以氧自由基为底物的金属酶，在有质子的介质中，它能迅速将Ｏ２-歧化，产生Ｏ２和Ｈ２Ｏ２，从而阻止了中间产物积累，据此原理可用来测定ＳＯＤ的活性。
１．４ 数据分析
试验数据均以表示，采用ＳＰＳＳ １７．０进行统计分析，多组间均数比较使用单因素方差分析（ＡＮＯＶＡ），然后使用ＬＳＤ检验比较两组间均数的差异性。统计检验水准ɑ＝０．０５。
２ 结果与分析
２．１ 毒死蜱对斑马鱼血清ＣＡＴ的影响以及维生素Ｅ对ＣＡＴ的保护作用
毒死蜱对斑马鱼血清ＣＡＴ的影响如图１所示。各浓度组在２４ ｈ时对ＣＡＴ活性都有激活效应，在４８ ｈ时达到最大（P﹤０．０５），中浓度产生的激活效应最明显（P﹤０．０１）。４８ ｈ后各浓度组ＣＡＴ活性都有不同程度的下降（P﹤０．０５），且都比２４ ｈ时活力低。１６８ ｈ后，中高浓度组ＣＡＴ活力基本丧失（P﹤０．０１）。
维生素Ｅ对ＣＡＴ活性的保护作用如图１所示。在９６ ｈ时，加了维生素Ｅ组的ＣＡＴ活性与高浓度组相比要高一些（P﹤０．０５），１６８ ｈ时高浓度组ＣＡＴ活力基本丧失（P﹤０．０１），而维生素Ｅ组ＣＡＴ活性基本和９６ ｈ一样，并且接近对照组。表明维生素Ｅ可以维持机体ＣＡＴ活性为正常水平。
２．２ 毒死蜱对斑马鱼血清ＳＯＤ的影响以及维生素Ｅ对ＳＯＤ的保护作用
毒死蜱对斑马鱼血清ＳＯＤ的影响如图２所示。同ＣＡＴ活性变化相似，各浓度组在２４ ｈ时对ＳＯＤ活性都有不同程度的激活作用（P﹤０．０５），在４８ ｈ时达到最大（P﹤０．０１），相比之下维生素Ｅ组产生的激活效应最明显（P﹤０．０１）。４８ ｈ后各浓度组ＳＯＤ活性都有不同程度的下降（P﹤０．０５），且都比２４ ｈ时活力低，其中高浓度组下降程度最明显（P﹤０．０１）。
维生素Ｅ对ＳＯＤ活性的保护作用如图２所示。在９６ ｈ时，加了维生素Ｅ组的ＳＯＤ活性与高浓度组相比酶活要高一些（P﹤０．０５），１６８ ｈ时高浓度组ＳＯＤ活力丧失明显，而维生素Ｅ组ＳＯＤ活性维持较高水平（P﹤０．０５），并且接近９６ ｈ。说明维生素Ｅ可以维持机体ＳＯＤ活性。
３ 小结与讨论
在正常情况下，机体内的氧自由基处于动态平衡状态，此时氧自由基对机体是无害的。一旦氧自由基过量，超过了细胞抗氧化防护的能力，就会造成氧化胁迫，进而影响机体正常生理活动，容易引起癌症、糖尿病、动脉粥样硬化以及各种神经退行性疾病［１２］。毒死蜱同其他有机磷类农药一样，会对生物体造成氧化胁迫，破坏氧自由基的代谢平衡，造成机体损伤［１３］。机体内部的各种组织和器官具有不同的代谢活力和耗氧量，它们抗氧化的能力也各不相同。农药对机体的伤害是渐进式的，首先是在血液中沉积，通过血液流到机体各个器官，造成器官代谢障碍，进而反馈影响血液中的代谢产物和合成产物发生紊乱［５］。所以，通过检测血液中生物标记物的改变，可以更直观地观察待检样品对机体过氧化损伤的情况。这种渐进式的中毒机制也导致了不同注射浓度和作用时间对机体产生的毒性效应出现差异。ＣＡＴ和ＳＯＤ是体内清除自由基的主要抗氧化酶，它们的活性很容易被体内氧化胁迫影响，所以检测它们的酶活性就可以反映机体受到氧化损伤的程度。
在低浓度毒死蜱胁迫下，斑马鱼血清中的ＣＡＴ活性显著升高；随着毒死蜱浓度的升高，酶活性又进而降低，这种现象即为“毒物兴奋效应”［１４］。由于在机体内，ＣＡＴ和ＳＯＤ是协同作用清除氧自由基，因此对农药胁迫的反应应该有相似的结果，这与试验所观察到的现象一致，两种酶的活性均先升高然后随着作用时间的延长而逐渐降低。在高浓度（０．２ ｍｇ／ｋｇ）毒死蜱胁迫下，ＳＯＤ活性升高幅度很小，几乎没有激活效应，而是直接下降，说明当受到重度逆境胁迫时，ＳＯＤ活性一般会降低。
维生素Ｅ在消除过氧化物，防止脂质过氧化方面作用显著，能清除体内的氧化应激物对机体抗氧化酶系的氧化胁迫，从而保护抗氧化酶，使其活性维持正常。试验中也观察到，维生素Ｅ对ＣＡＴ和ＳＯＤ有明显的保护作用，在毒死蜱胁迫９６ ｈ以后，维生素Ｅ使ＣＡＴ和ＳＯＤ活性与高浓度组相比维持一个较高水平。维生素Ｅ对抗氧化酶的保护作用可能是通过降低过氧化脂质水平，提高机体还原性谷胱甘肽含量，显著提高谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽巯基转移酶活性，从而维持机体内ＣＡＴ和ＳＯＤ的正常水平［１５］。
本试验采用肌肉注射法施毒，具有剂量准确、药效迅速的优点，同时可避免体腔注射对鱼体作用过于强烈和静水投毒无法精确掌握鱼体中毒量的缺陷。试验证明肌肉注射施毒可以作为毒理学研究的有效方法。本研究结果表明，毒死蜱对斑马鱼抗氧化系统有明显损伤作用，在日常的使用中应该注意施药浓度，以免危害水资源和水生生物。对已经遭到毒死蜱污染的生物可以尝试用维生素Ｅ来减轻机体伤害。
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