陈雄平
（华中农业大学作物遗传改良重点实验室，武汉 ４３００７０）
摘要： ＲｄＤＭ（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）是一种存在于植物中转录水平的基因沉默（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＴＧＳ）机制，需要ＤＣＬ３、ＲＤＲ２及ＡＧＯ４／６等多种蛋白介导 ｓｉＲＮＡ 同源位点的甲基化。拟南芥中发现了独立于ＲｄＤＭ的一条新ＴＧＳ途径，其关键蛋白为 ＡｔＮＥＲＤ１。ＡｔＮＥＲＤ１能够与ＡＧＯ２蛋白相互作用，产生２１ｎｔ的ｓＲＮＡs分子，介导某些新近进化基因的甲基化，并影响其组蛋白修饰。序列同源比对结果表明，水稻中存在有与ＡｔＮＥＲＤ同源非常高的蛋白，分别命名为ＯｓＮＥＲＤ１和ＯｓＮＥＲＤ２。体外结合试验结果表明，ＯｓＮＥＲＤ的ＰＨＤ结构域能够结合Ｈ３Ｋ４ｍｅ３，ＯｓＮＥＲＤ１参与下游基因的表观调控。对ＯｓＮＥＲＤ突变体中一些转座子的检测表明，该基因的突变会影响转座子的表达量变化及其表观修饰，并且这些转座子集中在ｇｙｐｓｙ家族，gｙｐｓｙ家族转座子在营养核中表达活跃，可能与ＯｓＮＥＲＤ１的花粉不育相关。
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关键词 ：ＮＥＲＤ；ｓＲＮＡ；ＲｄＤＭ；转座子；ＤＮＡ甲基化
中图分类号：Ｓ５１１；Ｑ７４ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）04－0988-05
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.04.057
收稿日期：２０１４－０８－０８
作者简介：陈雄平（１９８８－），男，湖南娄底人，在读硕士研究生，研究方向为水稻表观学，（电话）１５９２１１１２８５７（电子信箱）ｃｈｅｎｘｐ＠ｗｅｂｍａｉｌ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。
ｓＲＮＡｓ是一种广泛存在于动植物中非编码 ＲＮＡ（Ｎｏn－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ），在调控基因表达中发挥着重要的作用［１-３］。其中，ＲｄＤＭ（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）是联系表观修饰与ｓＲＮＡs的一条重要途径。ＲｄＤＭ通过产生２４ ｎｔ的 ｓＲＮＡs介导ｓｉＲＮＡ起始位点及其同源位点基因组ＤＮＡ的甲基化来实现对基因表达的调控，该过程依赖ＤＣＬ３和ＡＧＯ４／６［４］。水稻（Oryza sative）中也发现了一些ｍｉＲＮＡ同样可以介导内源性同源位点的ＤＮＡ甲基化［５］。此外，拟南芥中高通量数据中也发现一些ＲｄＤＭ途径的靶位点，不仅产生２４ ｎｔ的 ｓＲＮＡｓ，还可以产生２１ ｎｔ的ｓＲＮＡｓ［６］，这些发现使ｓＲＮＡｓ介导的ＤＮＡ甲基化更为复杂和多变。拟南芥ＡｔＮＥＲＤ１蛋白的发现给ｓｉＲＮＡ介导的ＤＮＡ甲基化和组蛋白修饰变化的研究提供了新方向。ＡｔＮＥＲＤ１的作用依赖于ＲＤＲ１／ＲＤＲ６以及ＡＧＯ２，而ＲＤＲ１／ＲＤＲ６及ＡＧＯ２目前只发现其在外源ｓｉＲＮＡ途径中发挥着作用［７］。因此，ＡｔＮＥＲＤ１通过ＲｄＤＭ以外的途径对基因组中的基因进行调控表达，且该途径可能影响植物性状和对外界环境适应性的表观变异与遗传。
ＮＥＲＤ途径在作物中是否保守目前仍然未在其他植物中报道，本研究通过序列比对在水稻中发现了两个与ＡｔＮＥＲＤ１同源的蛋白，一个为ＯｓＮＥＲＤ１突变体，突变体表型表现为花粉不育，其转座子表达量发生了改变，相应的甲基化修饰以及组蛋白修饰也发生了改变。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 突变体 研究使用的突变体为韩国突变体，编号为３Ｄ－００３７０，Ｔ－ＤＮＡ插入位点为第一个外显子，材料背景为Ｄｏｎｊｉｎｇ。
１．１．２ 引物 研究所用引物见表１。
１．２ 方法
１．２．１ 序列比对及进化树 进化树分析中水稻的蛋白质序列来自于ＭＳＵ（ｈｔｔｐ：／／ｒｉｃｅ．ｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ），其他各种植物的蛋白序列来源于网站Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ．ｎｅｔ／），采用ＣｌｕｓｔｅｒＸ软件进行多序列比对，并用ＭEＧＡ３．１ 构建进化树。
１．２．２ ＲＴ－ＰＣＲ 利用引物ｑｂ２ＮＤ１－Ｆ／Ｒ、ｑａ１ＮＤ１－Ｆ／Ｒ检测ＯｓＮＥＲＤ１基因插入位点后的表达量，具体步骤见教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献［８］。
１．２．３ 体外组蛋白结合试验 利用引物ｐｈｄＮ１－Ｆ／Ｒ扩增ＯｓＮＥＲＤ１的ＰＨＤ结构域区域，扩增片段经 ＢａｍＨ Ｉ及ＥｃｏＲ Ｉ酶切后连入ｐＧＥＸ－６Ｐ－１载体表达，体外组蛋白结合试验教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献［９］。
１．２．４ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ＯｓＮＥＲＤ１－ＧＳＴ蛋白用适当浓度的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离胶（１２．０％～１６．５％）进行分离，并转膜至Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司），蛋白电泳和转印系统为ＢＩＯ－ＲＡＤ公司的Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ?誖３ Ｃｅｌｌ（１６５－３３０１），具体过程参见说明书。转膜完成后，将膜用浸入２％牛血清白蛋白的磷酸缓冲液（ｐＨ ７．５）封闭 １ ｈ 或 ４ ℃过夜，取出后弃封闭液。按照 １∶１０ ０００的稀释比例在２％的牛血清白蛋白的磷酸缓冲液中加入一抗，ａｎｔｉ－ＧＳＴ、ａｎｔｉ－Ｈ３、ａｎｔｉ－Ｈ３Ｋ４ｍｅ３抗体购自Ａｂｃｏｍ公司以及Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司。室温下温育２ ｈ或４ ℃过夜，再经４次ＰＢＳ溶液和ＰＢＳＴ溶液（每１ Ｌ ＰＢＳ溶液添加８００ μＬ的吐温）洗膜（每次１５ ｍｉｎ），用ＰＢＳ溶液按照１∶１０ ０００的比例加入二抗，室温下温育１ ｈ，３次ＰＢＳ溶液 和 ＰＢＳＴ溶液洗膜（每次１５ ｍｉｎ），洗膜后用Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｇｅ显影，具体操作可依照说明书。
１．２．５ 甲基化敏感的酶切ＰＣＲ 取１～２ μｇ的ＯｓＮＥＲＤ１突变体及野生型（Ｄｏｎｊｉｎｇ）抽穗时期水稻ＤＮＡ大样，每１ μＬ体系加１０ Ｕ单位的甲基化敏感酶（Ｈｐａ ＩＩ，Ｍｓｐ Ｉ），３７ ℃酶切 １ ｈ以上，然后３７ ℃变性２０ ｍｉｎ，稀释至１００ μＬ 。取１ μＬ体系进行普通ＰＣＲ程序，引物设计位点为关注位点的两侧。
１．２．６ 染色质免疫沉淀 取ＯｓＮＥＲＤ１突变体及野生型（Ｄｏｎｊｉｎｇ）抽穗时期的叶片进行染色质免疫沉淀。将上述材料用甲醛溶液真空交联３０ ｍｉｎ，添加甘氨酸至终浓度０．１２５ ｍｍｏｌ／Ｌ，抽真空 ５ ｍｉｎ以终止交联。交联好的样品用灭菌水洗两次，吸干表面水分，经液氮磨碎后用双层Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ） 过滤两次并离心，４ ℃超声波破碎至ＤＮＡ片段主带为 ４００ ｂｐ左右，然后用Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｂｅａｄｓ孵育２ ｈ，洗去与ｂｅａｄｓ非特异性结合的染色质，随后加入特异性抗体孵育过夜，经不同缓冲液洗涤后，６５ ℃解交联过夜并纯化沉淀。采用Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ方法检测染色质修饰情况，引物为Ｏｓ０３ｇ５０６７０ｐ１－Ｆ／Ｒ、Ｏｓ０３ｇ５０６７０ｐ２－Ｆ／Ｒ、Ｏｓ０３ｇ５０６７０ｐ３－Ｆ／Ｒ，具体试验步骤教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献［８］。
２ 结果与分析
２．１ ＯｓＮＥＲＤ１是ＡｔＮＥＲＤ１的同源蛋白
截至目前，仅在拟南芥中报道了ＮＥＲＤ的存在［10］。序列比对分析表明，其他植物如大豆、玉米等也存在类似拟南芥ＮＥＲＤ蛋白，这证明ＮＥＲＤ在植物中是广泛存在的（图１）。水稻与拟南芥相对应出现了两个与ＡｔＮＥＲＤ同源的蛋白，分别命名为ＯｓＮＥＲＤ１及ＯｓＮＥＲＤ２。
２．２ ＯｓＮＥＲＤ１的ＰＨＤ结构域结合Ｈ３Ｋ４ｍｅ３能力的分析结果
ＰＨＤ结构域是表观修饰中重要的一种结构域，能够识别Ｈ３Ｋ４的甲基化状态［１１］。根据ＰＨＤ的结合特异性可分为2个大类，分别为能够结合未甲基化以及甲基化的Ｈ３Ｋ４组蛋白（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３），已报道拟南芥ＡｔＮＥＲＤ１结合Ｈ３Ｋ４ｍｅ０［７］。对ＯｓＮＥＲＤ１以及ＡｔＮＥＲＤ１进行序列比对可发现４个同源ＮＥＲＤ蛋白在ＰＨＤ结构域上有着很大的相似性。由此，本研究表达了ＯｓＮＥＲＤ１－ＰＨＤ－ＧＳＴ的原核蛋白（图２Ａ），进一步的体外组蛋白结合试验证明了ＯｓＮＥＲＤ１的ＰＨＤ结构域能够结合Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（图２Ｂ），与拟南芥中的ＡｔＮＥＲＤ１不同。ＯｓＮＥＲＤ１的ＰＨＤ结构域能够识别Ｈ３Ｋ４ｍｅ３，Ｈ３Ｋ４甲基化状态的改变会进一步改变染色质的结构，影响基因的表达，这证明ＯｓＮＥＲＤ１可能参与了基因表达的表观调控。
２．３ ＯｓＮＥＲＤ１突变体的分离和鉴定
从韩国突变体库中购买并检测到一个编号为 ３Ｄ－００３７０的Ｔ－ＤＮＡ插入突变体（图３Ａ），所用的引物为ｔｔ３６３９０Ｌ－３Ｄ／ｔｔ３６３９０Ｒ－３Ｄ（图３Ｂ）。设计ＲＴ－ＰＣＲ引物ｔｅａＮＤ１－Ｆ／Ｒ及ｔｅｂＮＤ１－Ｆ／Ｒ检测插入前后ＯｓＮＥＲＤ１基因的表达量，插入位点前ＯｓＮＥＲＤ１不表达，插入位点后的部分却是表达的（图３Ｃ）。Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测ＯｓＮＥＲＤ１基因的表达量发现该插入可导致插入后的基因部分超表达（图３Ｄ）。该插入影响了ＯｓＮＥＲＤ１基因的表达，因此可作为一个突变体材料挖掘ＯｓＮＥＲＤ１基因的功能。
２．４ ＯｓＮＥＲＤ１基因在水稻中的表达
对ＯｓＮＥＲＤ１基因在水稻中进行表达谱的检测，ＯｓＮＥＲＤ１基因在水稻的胚乳中表达量是比较高的（图３Ｅ）。此外，在抽穗期间的叶片中可以发现ＯｓＮＥＲＤ１基因表达水平也比较高（图３Ｄ）。由此推测ＯｓＮＥＲＤ１基因可能在水稻的生殖发育以及胚乳发育过程中起作用。
２．５ ＯｓＮＥＲＤ１基因突变对花粉育性的影响
大田种植观察到ＯｓＮＥＲＤ１突变体不育，进一步花粉碘染试验发现ＯｓＮＥＲＤ１突变体花粉不育（图４Ａ）。统计结果表明，野生型９３．５％可育，杂合体４７．０％可育，杂合体半不育也进一步说明了ＯｓＮＥＲＤ１影响花粉的育性。花粉的石蜡切片研究表明，突变体花药发育不正常，形态发生了改变；花粉粒也比野生型的少而且小（图４Ｂ）。
２．６ ＯｓＮＥＲＤ１突变对转座子的表达及其表观修饰的影响
水稻与拟南芥相比存在有大量的转座子元件且拟南芥中的ＯｓＮＥＲＤ１突变影响下游转座子基因的修饰，因此挑选了一些在甲基化酶突变体中表达受到影响的转座子［１２］，表达量检测结果表明，一些转座子在抽穗期叶片中表达量有较大变化（图５Ａ）。ＯｓＮＥＲＤ１突变下游变化最大的转座子属于Ｔｙ３－ｇｙｐｓｙ转座子家族，进一步挑选了一些其他的ｇｙｐｓｙ转座子检测其表达量，绝大部分该类型转座子表达量有了明显变化（图５Ｂ）。此外，相应位点的Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２以及Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３也有明显变化（图５Ｃ）。对其中变化最大的转座子Ｏｓ０３ｇ５０６７０检测其甲基化修饰，引物ｔｍ２位点的甲基化有变化（图５Ｄ）。因此，ＯｓＮＥＲＤ１突变能够影响转座子的表达，这种影响是通过组蛋白修饰及其甲基化修饰的改变来进行的。综上所述，ＯｓＮＥＲＤ１突变影响转座子的表达及其表观修饰，而在这些差异的转座子中，ｇｙｐｓｙ转座子占据了比较重要的一部分。
３ 小结与讨论
ＮＥＲＤ途径鲜有在单子叶模式植物中报道。本研究在单子叶模式植物水稻中证明单子叶植物中同样存在ＮＥＲＤ蛋白，由此可见ＮＥＲＤ蛋白广泛的存在于单子叶及双子叶植物中。对转座子的染色后免疫沉淀试验以及甲基化敏感的限制酶切ＰＣＲ技术分析，从下游基因的水平验证了ＯｓＮＥＲＤ１突变能够影响转座子的表观修饰。同时，ＯｓＮＥＲＤ１蛋白的ＰＨＤ结构域能够结合Ｈ３Ｋ４ｍｅ３甲基化，更进一步表明ＯｓＮＥＲＤ１基因参与水稻的表观调控。
在一些影响甲基化修饰或者ＲｄＤＭ途径中关键基因的一些突变体中，花粉不育是一个比较普遍的现象［１２，１３］。雄配子体形成即花粉的形成在植物表观遗传中有着非常重要的意义，决定了父代的何种表观修饰能够遗传给后代。拟南芥甲基化测序结果发现营养核与精核、小孢子细胞在ＣＨＨ甲基化上差异明显［１４］。这些差异区域８０％左右集中在ＬＴＲ／ｇｙｐｓｙ类型的转座子，９０％上为转座子元件。由此可见ｇｙｐｓｙ家族的转座子在花粉发育中占据着十分重要的作用。
ＯｓＮＥＲＤ１突变体中许多ｇｙｐｓｙ家族的转座子表达量及表观修饰出现了明显的变化，由此推测ＯｓＮＥＲＤ１可能通过影响ｇｙｓｐｓｙ转座子表达来影响水稻花粉的育性。ＯｓＮＥＲＤ１突变体相对于拟南芥中该突变体有更为明显的花粉不育表型，揭示了ＯｓＮＥＲＤ１及其调控ｇｙｐｓｙ转座子产生的２１ ｎｔ的ｓＲＮＡｓ在水稻花粉发育中的地位。将对ＯｓＮＥＲＤ１在水稻花粉发育中的作用开展进一步研究，这将补充说明子一代如何继承父本的表观修饰，给水稻育种工作提供新思路。
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（责任编辑 屠 晶）