李双石，张虎成，王铂伟，兰蓉，李浡
（北京电子科技职业学院生物工程学院，北京１０００２９）
摘要：酵母泥是葡萄酒酿造的主要副产物之一，废酵母泥中富含谷胱甘肽等生物活性物质。通过单因素试验和正交试验，对葡萄酒废酵母中的谷胱甘肽进行乙醇提取法工艺优化，确定最佳提取工艺条件为料液比１∶１０.0（m∶V）、乙醇体积分数３５％、浸提时间４５ ｍｉｎ和浸提温度５０ ℃，在此条件下谷胱甘肽的得率可高达２２．１％。
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关键词 ：葡萄酒废酵母；谷胱甘肽；乙醇提取法；工艺优化
中图分类号：Ｑ８１文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）03－0658-03
葡萄酒废酵母是葡萄酒酿造的主要副产物之一，其排放量占葡萄酒产量的４％～５％［１］。葡萄酒酵母泥富含营养物质，将其直接排放，不仅会造成排水的生物耗氧量负荷，而且也会造成很大的资源浪费和环境污染。因此，葡萄酒废酵母的高效再利用引起了国内外学者的关注。谷胱甘肽（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，ＧＳＨ）是由Ｌ－谷氨酸、Ｌ－半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成，是一种同时具有γ－谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物。ＧＳＨ具有多种生理功能，如作为抗氧化剂，可保护酶和其他蛋白质的巯基免受氧化，对部分外源毒性物质具有解毒作用，可治疗肝损伤、延缓衰老、增强免疫力等。因此，ＧＳＨ在临床医学、食品添加剂和化妆品等行业的需求不断增加，具有广阔的市场前景［２］。谷胱甘肽在自然界中广泛分布于动物、植物和微生物细胞内，其中以酵母、小麦胚芽和动物肝脏中含量较为丰富［２］。
目前，关于啤酒废酵母［３－５］、面包酵母［６，７］和玉米胚［８，９］的谷胱甘肽提取工艺研究较多，但利用葡萄酒废酵母提取谷胱甘肽的研究尚未见报道。刘超等［７］分别采用热水、乙醇、盐酸提取面包酵母中的ＧＳＨ，不同提取方法结果表明，乙醇提取法得到的ＧＳＨ提取率最高。舒嫒等［４］采用热水和乙醇提取啤酒酵母中的ＧＳＨ，试验结果表明乙醇提取法虽提取时间较长，但可大大缩短离心和浓缩时间，并且ＧＳＨ 损失少， 杂质含量较低。因此，本研究以葡萄酒废酵母为原料，采用乙醇提取法制备ＧＳＨ，并对其提取工艺进行优化，以期为葡萄酒废酵母资源的开发提供理论依据和技术参考。
１材料与方法
１．１材料、试剂与仪器
葡萄酒废酵母泥：北京电子科技职业学院葡萄酒中试生产得到，采自２０１３年１１月。
还原型谷胱甘肽标准品，国药集团化学试剂有限公司；５，５′－二硫代双（２－硝基苯甲酸）（ＤＴＮＢ）：美国Ｓｉｇｍａ公司。
ＴＤＺ４Ａ－ＷＳ型低速自动平衡离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；ＤＫ－Ｓ２４型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；ＡＲ５１２０型天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；ＵＶ－１８００ＰＣ型紫外／可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。
１．２方法
１．２．１葡萄酒废弃酵母ＧＳＨ醇法提取将葡萄酒泥与去离子水以１∶１混合（体积比），用６０目筛筛分，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ。重复上述步骤，直至所得沉淀为白色，上清液无色透明为止，收集沉淀，６０ ℃鼓风干燥处理，磨粉。精确称取１．０００ ０ ｇ葡萄酒废酵母放入三角瓶中，加入一定量一定体积分数的乙醇溶液，在一定温度下水浴处理一定时间，冷却至室温，以３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，取上清液，得到ＧＳＨ浸提液。
１．２．２ＧＳＨ含量的测定ＧＳＨ含量测定采用ＤＴＮＢ法［１０］。ＧＳＨ和ＤＴＮＢ反应生成黄色的５－硫代－２硝基苯甲酸，该物质在ｐＨ ８．０、４１２ ｎｍ波长处有最大吸收峰。
标准曲线的制作：取６支比色管，分别加入ＧＳＨ标准溶液（２００ ｍｇ／Ｌ） ０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５ ｍＬ，补去离子水至０．５ ｍＬ，再加入ｐＨ ８．０的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液１．５ ｍＬ和３％甲醛溶液０．５ ｍＬ，混匀反应２ ｍｉｎ，然后加入ＤＴＮＢ分析液２．５ ｍＬ，置于２５ ℃水浴反应５ ｍｉｎ后，４１２ ｎｍ波长下测定吸光度。以吸光度Ａ为纵坐标，ＧＳＨ浓度Ｃ为横坐标， 绘制标准曲线。
浸提液中ＧＳＨ含量测定：用０．５ ｍＬ ＧＳＨ浸提液代替ＧＳＨ标准溶液和水的混合物，用同样的显色方法测定浸提液中ＧＳＨ含量。
１．２．３单因素试验设计分别对影响ＧＳＨ乙醇提取工艺的主要因素料液比、乙醇体积分数、浸提时间和浸提温度进行单因素试验，考察各因素对葡萄酒废酵母ＧＳＨ提取率的影响。
１）料液比对ＧＳＨ提取率的影响。称取１．０００ ０ ｇ葡萄酒废酵母５份，分别加入４０％乙醇溶液８、９、１０、１１、１２ ｍＬ（m∶V，下同），于５０ ℃水浴搅拌９０ ｍｉｎ，冷却至室温，离心，取上清，检测ＧＳＨ浓度，计算ＧＳＨ提取率。
酵母谷胱甘肽提取率＝ＣＶｎ／ｍ×１００％
式中，Ｃ为粗提液中谷胱甘肽浓度，Ｖ为粗提液体积，ｎ为粗提液稀释倍数，ｍ为葡萄酒废酵母干粉质量。
２）乙醇体积分数对ＧＳＨ提取率的影响。称取１．０００ ０ ｇ酵母５份，分别加入１０ ｍＬ ２０％、３０％、４０％、５０％、６０％乙醇溶液，于５０ ℃水浴搅拌９０ ｍｉｎ，冷却至室温，离心，取上清液，检测ＧＳＨ含量，并计算ＧＳＨ提取率。
３）浸提时间对ＧＳＨ提取率的影响。称取１．０００ ０ ｇ酵母５份，分别添加４０％乙醇溶液１０ ｍＬ，于５０ ℃水浴搅拌３０、５０、７０、９０和１１０ ｍｉｎ，冷却至室温，离心后检测上清液中ＧＳＨ含量，计算ＧＳＨ提取率。
４）浸提温度对ＧＳＨ提取率的影响。称取１．０００ ０ ｇ酵母５份，分别添加４０％乙醇溶液１０ ｍＬ，于３０、４０、５０、６０、７０ ℃下水浴搅拌５ ｈ，冷却至室温，离心，检测上清液中ＧＳＨ含量，计算ＧＳＨ提取率。
１．２．４正交试验条件优化根据单因素试验结果确定葡萄酒废酵母多糖提取正交试验的因素和水平，如表１所示。采用４因素３水平的正交试验设计，对葡萄酒废酵母多糖提取工艺进行优化。
２结果与分析
２．１ＧＳＨ含量标准曲线的制作
采用ＤＴＮＢ法测定浸提液中ＧＳＨ含量，得到ＧＳＨ浓度Ｃ与吸光度Ａ的回归方程为Ａ＝０．００３ ５Ｃ－０．００４ １（Ｒ２＝０．９９６ ５），标准曲线如图１所示。
２．２单因素试验结果
２．２．１料液比对葡萄酒废酵母ＧＳＨ提取率的影响由图２可知，随着料液比的增加，葡萄酒废酵母ＧＳＨ浸提液中谷胱甘肽含量先缓慢增加，当料液比为１∶１０时谷胱甘肽提取率达到最大值，随后又略有降低。这主要是由于当乙醇溶液用量不足时，酵母细胞壁没有充分破碎，导致ＧＳＨ抽提不完全；但过量的乙醇溶液又容易造成ＧＳＨ氧化，导致ＧＳＨ提取率下降。因而，料液比初步确定采用１∶１０。
２．２．２乙醇体积分数对葡萄酒废酵母ＧＳＨ提取率的影响乙醇能增强酵母细胞膜类脂的流动性，可提高细胞的通透性，促进胞内物质释放。由图３可知，当乙醇体积分数小于３０％时，葡萄酒废酵母ＧＳＨ提取率随乙醇体积分数增加明显升高。但当乙醇体积分数大于３０％时，ＧＳＨ提取率随乙醇体积分数增加略有下降，这是由于ＧＳＨ是一种易溶于水和稀醇，微溶于醇的活性肽［７］，乙醇的体积分数较大时反而不利于ＧＳＨ的提取。因此乙醇体积分数初步确定为３０％。
２．２．３浸提时间对葡萄酒废酵母ＧＳＨ提取率的影响由图４可知，浸提时间在５０ ｍｉｎ时，葡萄酒废酵母ＧＳＨ提取率最大；超过５０ ｍｉｎ后，葡萄酒废酵母ＧＳＨ提取率呈缓慢的下降趋势，这可能是由于ＧＳＨ在空气中受到氧化不稳定，从而导致含量下降。因此，可初步确定谷胱甘肽浸提时间为５０ ｍｉｎ。
２．２．４浸提温度对葡萄酒废酵母ＧＳＨ提取率的影响由图５可知，随着浸提温度的升高，葡萄酒废酵母ＧＳＨ提取率呈先升后降的趋势，在５０ ℃时达到最大值。这是由于浸提温度对ＧＳＨ稳定性有较大影响，ＧＳＨ的氧化速度与温度呈负相关［７］，高温可破坏ＧＳＨ的活性；但浸提温度如果过低，也将阻碍乙醇与酵母细胞壁和细胞膜的相互作用，不利于ＧＳＨ溶出。因此，初步确定５０ ℃为葡萄酒废酵母ＧＳＨ的浸提温度。
２．３正交试验优化结果
在单因素试验结果的基础上，采用正交试验设计对葡萄酒废酵母多糖提取工艺条件进行优化，试验结果如表２所示。由表２可知，用乙醇提取法制备葡萄酒废酵母中谷胱甘肽的最佳工艺条件为料液比１∶１０.0、乙醇体积分数３５％、浸提时间４５ ｍｉｎ、浸提温度５０ ℃，此条件下谷胱甘肽的提取率为２２．１％。
从表２的极差分析可知，各因素对谷胱甘肽提取的影响程度依次为Ｃ、Ａ、Ｄ、Ｂ，即浸提时间对谷胱甘肽提取率的影响最大，其次为浸提温度和料液比，而乙醇体积分数的影响最小。
３结论
葡萄酒废酵母中含有丰富的活性物质，谷胱甘肽为其中的一种活性多肽。本试验通过单因素和正交试验对葡萄酒废酵母谷胱甘肽的提取工艺进行优化，确定最佳提取工艺条件为料液比１∶１０.0、乙醇体积分数３５％、浸提时间４５ ｍｉｎ、浸提温度５０ ℃，在此条件下谷胱甘肽的提取率可达２２．１％。邵伟等［3］、凌秀梅等［5］从啤酒废酵母中提取ＧＳＨ，ＧＳＨ提取率较高，分别为２３．３７％和２９％以上，这与原料、ＧＳＨ检测方法不同有关。乙醇提取法是一种较温和的提取方法，且具有工艺简单、成本低廉、乙醇可回收再利用等特点，因此具有一定的应用前景。
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参考文献：
［１］ 杜娜，杨学山，韩舜愈，等．葡萄酒泥酵母超氧化物歧化酶分离提取工艺条件优化［Ｊ］．食品工业科技，２０１３，３４（１５）：２４２－２４５．
［２］ 冮洁，单立峰．谷胱甘肽的生产及其在食品工业中的应用［Ｊ］．中国调味品，２００９，３２（２）：４０－４４．
［３］ 邵伟，乐超银，唐明，等．啤酒废酵母中谷胱甘肽提取工艺条件优化研究［Ｊ］．食品科学，２００８，２９（５）：１７３－１７６．
［４］ 舒嫒，王家骐，朱立江，等．酵母中还原型谷胱甘肽的提取方法研究［Ｊ］．发酵科技通讯，２００８，３７（３）：１６－１９．
［５］ 凌秀梅，邱树毅，胡鹏刚，等．响应面法优化从啤酒废酵母中提取谷胱甘肽工艺条件［Ｊ］．中国酿造，２００７（７）：３５－３８，４４．
［６］ 陈娜，乔长晟，胡玉霞，等．面包酵母中谷胱甘肽抽提方法的研究［Ｊ］．现代食品科技，２００８，２４（２）：１５７－１６0．
［７］ 刘超，袁建国，高艳华，等．酵母还原型谷胱甘肽提取条件的优化［Ｊ］．食品与药品，２０１１（７）：２３４－２３７．
［８］ 王鑫，徐丽萍，李旭，等．玉米胚谷胱甘肽提取工艺的研究［Ｊ］．哈尔滨商业大学学报（自然科学版），２００９，２５（５）：５９０－５９２，６０３．
［９］ 徐丽萍，王鑫，邢超．溶剂法纯化还原型谷胱甘肽工艺的研究［Ｊ］．食品工业科技，２０１１（１２）：３４８－３５０．
［１０］ 李从军，谢爱娣．酵母提取液中谷胱甘肽定量测定方法的比较［Ｊ］．食品与发酵工业，２０１０，３６（７）：１５８－１６２．