李洪枚
（首都经济贸易大学安全与环境工程学院，北京 １０００７０）
摘要：研究用辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）催化氧化法处理水中己烯雌酚（ＤＥＳ）的适宜工艺反应条件。试验考察了反应温度、ｐＨ和反应物反应计量比等对ＤＥＳ去除率的影响。结果显示，在ｐＨ４．５、２５ ℃、［ＨＲＰ］０／［ＤＥＳ］０为１.000 Ｕ／μｍｏｌ和ＭＨ■Ｏ■∶ＭＤＥＳ（反应摩尔比）为１∶２的反应条件下，反应３ ｈ，ＤＥＳ去除率可达到９２．０８％。研究表明，ＨＲＰ催化Ｈ２Ｏ２氧化ＤＥＳ反应的适宜条件是：ｐＨ４．５左右，温度２５ ℃左右，［ＨＲＰ］０／［ＤＥＳ］０为１.000 Ｕ／μｍｏｌ，ＭＨ■Ｏ■：ＭＤＥＳ宜大于０．５；过量Ｈ２Ｏ２抑制ＨＲＰ催化活性；ＤＥＳ起始浓度越高，其去除速率越大；以底物ＤＥＳ去除速率表示的最大反应速率Ｖｍａｘ和米氏常数Ｋｍ分别为７４．６３ ｍｍｏｌ／（Ｌ·ｈ）和４６．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ。
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关键词 ：酶催化氧化；处理；己烯雌酚
中图分类号：Ｘ１３１；ＴＱ４２６．９７ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）02－0331-05
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.019
己烯雌酚（ｄｉｅｔｈｙｌｉｂｅｓｔｒｏｌ，ＤＥＳ）是一种人工合成的药用非甾体雌激素，与天然雌激素雌二醇有相同的功效，主要用于治疗雌激素低下症等疾病，部分女性保健品和化妆品中也含有一定量的ＤＥＳ［１］。ＤＥＳ是一种生物活性很强的环境激素，水体中微量ＤＥＳ可诱导雄鱼体内卵黄蛋白原明显升高，具有很强的内分泌干扰能力［２］。有研究显示孕妇吸收ＤＥＳ，其男孙代出现尿道下裂几率高［３］。ＤＥＳ还可引起基因突变而诱发癌症［４－６］，长期食用含微量ＤＥＳ的食品可导致儿童性早熟、男性精子畸形和雌性化等危害［７，８］。因此，国内外对ＤＥＳ作为药物使用进行了严格限制，尤其是禁止将ＤＥＳ用作饲料添加剂［９］。遗憾的是，我国部分畜禽养殖企业为提高畜禽产量，违法在饲料中添加ＤＥＳ，导致禽蛋和肉类食品中ＤＥＳ残留量高达０．２～１０．０ ｍｇ／ｋｇ，存在极大的健康隐患［１０，１１］。环境中的ＤＥＳ主要来自药品生产企业、医院、养殖企业和居民生活等产生的污水［１２］， 报道显示我国部分地区地表水中ＤＥＳ的浓度达到６ ｎｇ／Ｌ［１３］，部分城市的污水处理厂出水中ＤＥＳ的浓度为０．３～６．２ ｎｇ／Ｌ［１４，１５］。西班牙有关污水处理厂排出水中ＤＥＳ浓度为３４ ｎｇ／Ｌ［１６］。可见，现有污水处理工艺还不能有效去除水中ＤＥＳ。而国内外仅有几篇用光催化氧化法处理水体中ＤＥＳ的研究报道［１７－２１］， 相关研究很少。酶催化氧化处理废水中有机污染物以其反应条件温和、反应快和选择性好等优点而受到广泛关注，本研究选用辣根过氧化物酶（Hｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＨＲＰ）催化Ｈ２Ｏ２氧化水中微量ＤＥＳ，试验考察反应温度、ｐＨ、Ｈ２Ｏ２和ＤＥＳ初始浓度等反应条件对ＨＲＰ催化氧化ＤＥＳ过程的影响，得到适宜的反应工艺参数，为进一步建立ＨＲＰ处理实践中含ＤＥＳ废水新技术提供依据。
１ 材料与方法
１．１ 仪器与试剂
Ａｇｉｌｇｅｎｔ １２００型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）， 色谱柱为Ｂｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ柱（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ），Ｃａｒｙ ５０型紫外可见分光光度计（美国瓦里安公司），ＬＹ－１０００型恒温培养振荡器（江苏金坛市亿通电子有限公司），ＰＨＳ－３Ｃ型精密ｐＨ计（上海精密科学仪器有限公司），ＳＫＹ－１００Ｃ型恒温培养振荡器（上海苏坤实业有限公司），单道可调式移液器（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司，两种规格：１０～２００ μL和１００～１ ０００ μL），ＦＡ２００４型电子天平（上海精密科学仪器有限公司），１０ ｍＬ带有刻度的棕色避光瓶。
试验用试剂从Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ公司购买，包括色谱纯试剂己烯雌酚、甲醇、乙腈和２，２′－联氮双（３－乙基苯并噻唑啉－６－磺酸）（ＡＢＴＳ），分析纯试剂双氧水（３０％Ｈ２Ｏ２）、磷酸二氢钾、正磷酸（８５％Ｈ3ＰＯ４）、冰乙酸、硼酸、聚乙二醇辛基苯基醚（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、氢氧化钾和氢氧化钠，生化试剂辣根过氧化物酶（ＨＲＰ，２５０～３３０ Ｕ／ｍｇ）、过氧化氢酶（２ ０００～５ ０００ Ｕ／ｍｇ）和牛血清白蛋白（纯度大于９８％），去离子水（Ｈｉｔｅｃｈ－Ｓｃｉｅｎｃｅｔｏｏｌ超纯水系统制备）。
１．２ 试验方法
１．２．１ 溶液的配制 ＤＥＳ标准贮备溶液：准确称量２．５ ｍｇ ＤＥＳ，置于１００ ｍＬ容量瓶中，用甲醇定容备用（注：ＤＥＳ在水中几乎不溶，故用甲醇配制），浓度为０．０９３ ２７ ｍｍｏｌ／Ｌ。考虑到酶促反应速度快及其与工业废水中ＤＥＳ浓度的相近程度，本试验采用ＤＥＳ初始浓度为０．０３７ ３ ｍｍｏｌ／Ｌ。
ＨＲＰ溶液：准确称取１ ｍｇ ＨＲＰ溶于２５０ ｍＬ去离子水中，再用单道可调式移液器移取１ ｍＬ ＨＲＰ溶液于１００ ｍＬ容量瓶中用去离子水定容，测得其活性为０．６２４ ８ Ｕ／ｍＬ，置于４ ℃避光条件下保存待用， 保存时间不超过１周。
Ｈ２Ｏ２溶液：含３０％Ｈ２Ｏ２的双氧水，密度为１．１２２ ｇ／ｃｍ３。取１ ｍＬ双氧水于１００ ｍＬ容量瓶中用去离子水定容，再从１００ ｍＬ Ｈ２Ｏ２溶液中取１ ｍＬ于５０ ｍＬ容量瓶中定容，此时配得的Ｈ２Ｏ２溶液浓度为１．９６ ｍｍｏｌ／Ｌ，４ ℃避光保存。Ｈ２Ｏ２溶液在使用之前配制。
过氧化氢酶溶液：准确称取０．５３１ ４ ｍｇ过氧化氢酶溶于去离子水中配成１０ ｍＬ溶液， 测得其活性约为１７０ Ｕ／ｍＬ［２２］， 过氧化氢酶溶液在使用之前配制。
Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ缓冲溶液配制方法教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献［２３］。
１．２．２ 反应体系的建立 反应在１０ ｍＬ带有刻度的棕色避光瓶中进行。首先通过计算确定好１０ ｍＬ反应混合液中各组成部分所需要的量（体积），然后用单道可调式移液器依次移取一定量的ＤＥＳ标准储备溶液和ＨＲＰ溶液至避光瓶中，再加入Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ缓冲溶液，置于恒温振荡器中孵育１５ ｍｉｎ，最后加入Ｈ２Ｏ２溶液，使反应混合液总体积为１０ ｍＬ。盖好避光瓶，并置于恒温培养振荡器中振荡（１５０ ｒ／ｍｉｎ）。定时取样，并加入一定量过氧化氢酶使Ｈ２Ｏ２分解而终止反应（可直接在离心管中进行）［２４］。将样品离心１０ ｍｉｎ，移取上清液，分析ＤＥＳ残留浓度，计算ＤＥＳ去除率。
１．２．２ 分析方法 ＤＥＳ浓度测定：用ＨＰＬＣ法，色谱条件是：色谱柱为Ｂｅｃｋｍａｎ ＵｌｔｒａｓｐＨｅｒｅ ＯＤＳ柱（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ），流动相为甲醇和水（７０∶３０，Ｖ／Ｖ），流速和进样体积分别为１．０ ｍL／ｍｉｎ和５ μＬ，检测波长为２４０ ｎｍ，停留时间６．０ ｍｉｎ，ＤＥＳ检测的标准方程：峰面积＝９ ８９１．６ＣＤＥＳ－６．１０６ ２，Ｒ２＝０．９９８ ６。每次检测做３个平行样品，误差小于５％。每次样品测量前都采用外标法确定ＤＥＳ校准曲线方程，再确定未知样ＤＥＳ浓度。
ＨＲＰ活性测定采用ＡＢＴＳ法［２５］。
２ 结果与分析
２．１ ｐＨ对ＤＥＳ去除效果的影响
试验测量了不同ｐＨ条件下ＤＥＳ的去除率，考察反应体系ｐＨ变化对ＨＲＰ催化氧化ＤＥＳ过程的影响。反应起始条件是：［ＤＥＳ］０＝０．０３７ ３ ｍｍｏｌ／Ｌ，［Ｈ２Ｏ２］０＝０．０１８ ６５ ｍｍｏｌ／Ｌ，ＨＲＰ起始活性为０．０３７ ３ Ｕ／ｍＬ，反应温度为２５ ℃，反应时间为６０ ｍｉｎ，反应体系的ｐＨ分别为３．１６、３．９８、４．５１、４．９０、６．００、７．００、８．０８和９．０３。结果如图１所示。
由图１可以看出，ＤＥＳ的去除率随ｐＨ的增加呈钟型变化，即在３．１６～９．０３范围内，ＤＥＳ去除率随ｐＨ增加先升高后降低；ｐＨ为４．５１时，ＤＥＳ的去除率达到最高值９３．６２％；ｐＨ小于３．１６或大于９．０３时，ＤＥＳ去除率比较低，ＨＲＰ催化活性受到限制。试验结果表明，ＨＲＰ能在一个比较宽的ｐＨ范围内催化氧化ＤＥＳ，适宜ｐＨ为４．５１。
ＨＲＰ能在ｐＨ４.00～１１.00范围内催化底物反应，因底物不同存在差异，催化多数底物反应的适宜ｐＨ在７．０0左右，ｐＨ小于４.00或大于１１.00时，ＨＲＰ催化活性很低［２６，２７］。但也有研究报道ＨＲＰ催化Ｈ２Ｏ２氧化五氯代酚的适宜ｐＨ范围为４.00～５.00［２８］，与本研究结果比较相近。因此，以下试验均选择ｐＨ为４．５0的缓冲溶液作为酶促反应介质，以保持ＨＲＰ催化活性的相对稳定。
２．２ 温度对ＤＥＳ去除率的影响
反应起始条件是：［ＤＥＳ］０＝０．０３７ ３ ｍｍｏｌ／Ｌ，［Ｈ２Ｏ２］０＝０．０１８ ６５ ｍｍｏｌ／Ｌ，ＨＲＰ起始活性为０．０３７ ３ Ｕ／ｍＬ，ｐＨ为４．５0，反应时间为３０ ｍｉｎ，反应体系的温度分别为１５、２０、２５、３０、３５和４０ ℃。结果如图２所示。
由图２可以看出，ＤＥＳ去除率随着反应体系温度的升高而逐渐升高，当温度超过３５ ℃时，去除率急剧下降；反应温度为２５ ℃时，ＤＥＳ去除率达到最大值９０．１３％；温度在１５ ～３５ ℃范围内时，ＤＥＳ去除率均在８０％以上。因此，ＨＲＰ能在较宽的温度范围内催化氧化ＤＥＳ，适宜温度为２５ ℃。温度对酶催化反应的影响表现在两个方面：一是随着温度升高，酶促反应活化分子增加，反应速率增大；二是反应温度升高到一定值后，酶蛋白会发生变性，失去催化活性，导致酶促反应速率下降。这两种相反效应使得酶促反应存在一个适宜的温度范围。试验结果表明，温度超过３５ ℃时，ＨＲＰ催化活性明显减弱，ＤＥＳ去除率仅为４７％。研究ＨＲＰ适宜的催化反应温度，有助于保护ＨＲＰ的催化活性，提高ＤＥＳ去除率。
２．３ ＨＲＰ与ＤＥＳ用量之比对ＤＥＳ去除率的影晌
酶的用量直接影响其工程应用成本，考察ＨＲＰ用量对ＤＥＳ去除率的影响，选择最适宜的ＨＲＰ用量（［ＨＲＰ］０表示酶起始用量，Ｕ／ｍＬ），对降低工程应用成本具有重要作用。反应起始条件是：［ＤＥＳ］０＝０．０３７ ３ ｍｍｏｌ／Ｌ，［Ｈ２Ｏ２］０＝０．０１８ ６５ ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ为４．５0，反应温度为２５ ℃，［ＨＲＰ］０／［ＤＥＳ］０起始比分别为０．１２５、０．２５0、０．５00、1.000和２.000 Ｕ／μｍｏｌ，反应时间分别为３０和１８０ ｍｉｎ。结果如图３所示。
由图３可以看出，随着［ＨＲＰ］０ /［ＤＥＳ］０增大， 即随着ＨＲＰ起始用量增加，ＤＥＳ去除率升高。当［ＨＲＰ］０ ／［ＤＥＳ］０分别为０．２５0、０．５.00、１.000和２.000 Ｕ／μｍｏｌ，反应１８０ ｍｉｎ后，ＤＥＳ去除率分别为８９．８１％、９０．６７％、９２．０８％和９０．５１％， ＤＥＳ去除率相差比较小，表明［ＨＲＰ］０ /［ＤＥＳ］０达到一定量后，能够满足底物去除要求，过多的酶对反应没有催化作用。［ＨＲＰ］０／［ＤＥＳ］０小于０．２５ Ｕ／μｍｏｌ时，ＤＥＳ去除率比较小，表明酶量不足。综合考虑反应速度和ＨＲＰ催化活性随反应过程进行而减弱等因素，宜选择［ＨＲＰ］０／［ＤＥＳ］０＝１.000 Ｕ／μｍｏｌ作为反应体系中ＨＲＰ与ＤＥＳ的最佳配比。
２．４ Ｈ２Ｏ２浓度对ＤＥＳ去除率的影晌
如果仅考虑Ｈ２Ｏ２与ＤＥＳ发生的氧化还原反应， 那么提高Ｈ２Ｏ２浓度，会加快反应速度，增大ＤＥＳ去除率。但过量的Ｈ２Ｏ２容易使ＨＲＰ失去催化活性［２０］。因此，必须综合考虑ＨＲＰ催化活性和ＤＥＳ的去除率，选择适宜的Ｈ２Ｏ２用量。本试验在其他条件一定的情况下，通过改变Ｈ２Ｏ２浓度考察Ｈ２Ｏ２用量对ＤＥＳ去除率的影晌。反应起始条件是：［ＤＥＳ］０＝０．０３７ ３0 ｍｍｏｌ／Ｌ，ＨＲＰ起始活性为０．０３７ ３0 Ｕ／ｍＬ，ｐＨ为４．５0，温度为２５ ℃，Ｈ２Ｏ２的浓度分别为０．００４ ６６、０．００９ ３２、０．０１８ ６５、０．０３７ ３0、０．０７４ ６0、０．１４９ ２0和０．２９８ ４0 ｍｍｏｌ／Ｌ。结果如图４所示。
由图４可以看出，当Ｈ２Ｏ２浓度比较低时，如０．００４ ６６和０．００９ ３２ ｍｍｏｌ／Ｌ，反应２ ｈ，ＤＥＳ去除率小于７０％，且反应速率（曲线的斜率）小，表明Ｈ２Ｏ２ 浓度低，反应速率小，不能将ＤＥＳ全部氧化；当Ｈ２Ｏ２浓度处于０．０１８ ６５～０．０７４ ６0 ｍｍｏｌ／Ｌ范围内时，反应２ ｈ，ＤＥＳ去除率达到９０％以上，反应速率大；Ｈ２Ｏ２浓度为０．０７４ ６0 ｍｍｏｌ／Ｌ时，ＤＥＳ去除率达到最大值９２．５７％；当Ｈ２Ｏ２浓度达到０．１４９ ２0 ｍｍｏｌ／Ｌ时，反应２ ｈ后，ＤＥＳ去除率小于８０％，表明Ｈ２Ｏ２浓度过高，对ＨＲＰ催化氧化ＤＥＳ过程有明显的抑制作用，原因是过量Ｈ２Ｏ２与反应中间产物ＨＲＰ－ＩＩ进一步作用生成一种没有催化能力的副产物ＨＲＰ－Ⅲ［２９］，从而降低ＤＥＳ的去除率。进一步用Ｈ２Ｏ２与ＤＥＳ的反应摩尔比进行分析，数据处理结果参见图５。图５是反应２ ｈ后，ＤＥＳ去除率随ＭＨ2Ｏ2∶ＭＤＥＳ的变化曲线。
由图５可以看出，ＭＨ2Ｏ2：ＭＤＥＳ为１／８～２时，反应２ ｈ后，ＤＥＳ去除率从６０．１３％上升到９２．５７％，ＤＥＳ去除率随ＭＨ2Ｏ2∶ＭＤＥＳ增大而增大；当ＭＨ2Ｏ2∶ＭＤＥＳ为４时，ＤＥＳ去除率下降明显，过量Ｈ２Ｏ２抑制了ＨＲＰ催化反应过程。理论上讲，ＨＲＰ催化氧化１ ｍｏｌ ＤＥＳ，只需要０．５ ｍｏｌ Ｈ２Ｏ２，即ＭＨ2Ｏ2∶ＭＤＥＳ为０．５时，ＤＥＳ去除率应达到最大［２１］，但反应２ ｈ，ＭＨ2Ｏ2∶ＭＤＥＳ为０．５～２.0时，ＤＥＳ去除率分别为９０．０１％、９１．０５％和９２．７５％。显然，其他条件一定时，要完全氧化１ ｍｏｌ ＤＥＳ，ＭＨ2Ｏ2∶ＭＤＥＳ需大于０．５。有关ＨＲＰ催化Ｈ２Ｏ２氧化酚类底物的研究报道显示，ＭＨ2Ｏ2：Ｍ底物因底物不同比值可以为０．５［３０］、１.0［３１］和１．６［３２］。反应消耗较多的Ｈ２Ｏ２，可能是由于底物氧化产物如二聚体小分子进一步被ＨＲＰ催化氧化而增大了Ｈ２Ｏ２用量，使得Ｈ２Ｏ２用量高于理论用量［３３］。
２．５ ＤＥＳ起始浓度对去除速率的影晌
本试验通过测量反应初始３０ ｍｉｎ内ＤＥＳ去除速率（用３０ ｍｉｎ内ＤＥＳ浓度变化除以３０ ｍｉｎ得到的平均反应速率， 即去除速率）， 考察ＤＥＳ起始浓度对去除速率的影响，即对单位时间内ＤＥＳ浓度变化率的影响。反应初始条件是［Ｈ２Ｏ２］０＝０．０１８ ６５ ｍｍｏｌ／Ｌ，ＨＲＰ起始活性为０．０３７ ３0 Ｕ／ｍＬ， ｐＨ为４．５，温度为２５ ℃。ＤＥＳ初始浓度分别为０．０１８ ７0、０．０２７ ８0、０．０３７ ３0 、０．０４６ ６0和０．０５６ ０0 ｍｍｏｌ／Ｌ，反应时间为３０ ｍｉｎ。结果如图６所示。
由图６可以看出，在反应的最初３０ ｍｉｎ内，ＤＥＳ去除速率随其起始浓度的增大而增大。原因是ＨＲＰ催化Ｈ２Ｏ２氧化底物的４个反应步骤中， ＤＥＳ参与了其中的两个反应， ＤＥＳ浓度高，反应速率快，ＤＥＳ去除速率增大［３４］。当ＤＥＳ起始浓度大于０．０３７ ３0 ｍｍｏｌ／Ｌ时，ＤＥＳ去除速率增加幅度开始减小，表明酶催化初始反应速率受ＨＲＰ量的限制，过多的ＤＥＳ对反应速率影响很小。进一步用双倒数法（浓度倒数和速率倒数）处理实验数据，可得到以底物ＤＥＳ表示的最大反应速率Ｖｍａｘ和米氏常数Ｋｍ，
（图７），Ｖ是ＤＥＳ去除速率（３０ ｍｉｎ内的ＤＥＳ平均去除速率），单位为ｍｍｏｌ/（Ｌ·ｈ）。可以求出Ｖｍａｘ＝７４．６３ ｍｍｏｌ／（Ｌ·ｈ），Ｋｍ＝４６．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ。本试验结果得到Ｋｍ值比ＨＲＰ催化１７β－雌二醇等雌激素反应的米氏常数大［３５］，原因可能是本数据处理使用３０ ｍｉｎ内的平均速率代替初始反应速率，存在一定的误差。当然，底物不同，同一种酶催化底物反应的Ｖｍａｘ和Ｋｍ也不同。
３ 结论
试验得出以下结论：
１）ＨＲＰ 催化Ｈ２Ｏ２氧化ＤＥＳ的适宜ｐＨ为４．５１。
２）ＨＲＰ催化Ｈ２Ｏ２氧化ＤＥＳ的适宜温度为２５ ℃。
３）ＤＥＳ去除率随［ＨＲＰ］０/［ＤＥＳ］０增大而升高。当［ＨＲＰ］０/［ＤＥＳ］０大于０．５ Ｕ／μｍｏｌ时， ＤＥＳ去除率超过９０％。［ＨＲＰ］０/［ＤＥＳ］０的适宜比值为１.000 Ｕ/μｍｏｌ。
４）ＨＲＰ催化Ｈ２Ｏ２氧化ＤＥＳ的ＭＨ2Ｏ2∶ＭＤＥＳ宜大于０．５，以确保ＤＥＳ的去除率达到１００％。Ｈ２Ｏ２用量过高，会抑制ＨＲＰ催化活性，不利于ＤＥＳ的去除。
５）ＤＥＳ起始浓度越高，其去除速率越大。以底物ＤＥＳ表示的最大反应速率Ｖｍａｘ和米氏常数Ｋｍ分别为７４．６３ ｍｍｏｌ／（Ｌ·ｈ）和４６．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ。
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（责任编辑 蔡端午）