童淑芬1 熊豫麟2 贺 铭1
（1.昆明医科大学基础医学院实验教学中心细胞与分子生物学实验室，云南 昆明 650500；
2.昆明医科大学图书馆，云南 昆明 650500）
【摘 要】提出了用薄层层析技术快速测定胆固醇含量鉴定地沟油的方法。实验结果表明，当标准胆固醇含量大于1 μg时，可以明显观察到胆固醇染色点，且油品胆固醇含量随地沟油含量的增加而成线性增加，市售合格的食用植物油均未检测出胆固醇。据此实验结果特征，可作为判断食用植物油是否掺混地沟油的依据。
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关键词 地沟油；植物油；胆固醇；薄层层析
地沟油又名餐厨废弃油脂、潲水油、垃圾油等，常被回收加工后用作生产工业用油或生物燃油的原料。近年来，一些不法之徒在利益驱使下，将提炼的地沟油勾兑至植物油中，甚至直接冒充食用植物油销售。误食后将损害人体健康。地沟油成分较为复杂，常混有动物源性物质。因此，使用餐饮废弃物加工而成的油品中不可避免地混有动物脂肪[1]。胆固醇又称胆甾醇，是动物油脂的特征性甾醇，而植物油中一般不含或含有极少量的胆固醇[2]，所以，通过检测油品中胆固醇含量可以达到识别油品的目的。
目前，国内检测胆固醇的方法主要有液相色谱法[3]、气相色谱法[4]、薄层色谱法[5]等。考虑到以上检测技术需要购买昂贵的设备，且操作复杂，需专业技术人员操作，耗时长，成本较高等因素，本研究采用简便易行的硅胶薄层层析技术对油品中的胆固醇进行测定。油品经直接皂化法[6]处理后，胆固醇作为不皂化物分离提取出来，再采用硅胶薄层层析法检测胆固醇含量[7]。
1 材料与方法
1.1 实验材料
地沟油，由昆明市产品质量监督检验所提供；超市所购大豆油、菜籽油、花生油、调和油。
1.2 实验试剂及仪器
主要试剂：乙醇；石油醚；冰乙酸；浓硫酸、异辛烷、醋酸乙酯。胆固醇标准液：胆固醇（分析纯）加入无水乙醇配制成2 mg/mL胆固醇标准液，4℃保存；50%氢氧化钾溶液：称取50 g氢氧化钾，用蒸馏水溶解定容至100 mL。5%氯化钠溶液：称取5 g氯化钠，用蒸馏水溶解定容至100 mL；显色液：磷钼酸2.5 g溶于冰乙酸100 mL，再加浓硫酸5 mL（临用前配制）。全部试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。
主要仪器：硅胶G薄层层析板（青岛海洋化工厂）、玻璃层析缸（上海楚定分析仪器有限公司）、电热恒温水箱（上海一恒科技有限公司）、漩涡混合器（上海精科实业有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）、佳能G9数码相机（佳能公司）。
1.3 实验方法
1.3.1 标准曲线绘制
将胆固醇标准液等比稀释为2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL，用微量移液器各取5 μL（相当于胆固醇标准上样量为10、5、2.5、1.25、0.625 μg）点样于硅胶G薄层层析板上，置于层析缸展层。展开剂：异辛烷:醋酸乙酯为2:1(V/V)。待展开剂前沿升至层析板上端约1 cm处，取出晾干层析板。将现配的显色剂均匀喷雾于层析板，待晾干后平置于85℃烤箱中加热，约15min后色斑成色。
1.3.2 样品测定
各取实验油品0.5mL，加入4mL无水乙醇，0.5mL50%氢氧化钾溶液，在65℃恒温水浴中皂化1h，皂化过程中每20min振摇一次，使之皂化完全。皂化完毕后，取出试管，室温冷却。加入3mL5%氯化钠溶液，10 mL石油醚，盖紧瓶盖，在电动振荡器上振摇2min，静置分层。取上层石油醚清液2mL于新试管中，置于65℃水浴中自然挥干，加入100μL冰乙酸溶解沉淀。用微量移液器取5μL点样于硅胶G薄层层析板，置于层析缸中展开，用显色剂呈色后，数码相机拍照后，利用ImageJ软件测算样品点的灰度值。根据标准曲线计算其胆固醇含量。
1.3.3 计算
测量胆固醇的迁移距离：用直尺测量点样点至各个色斑中心的距离（精确至毫米），再测量点样点至层析最前沿条带的距离。计算胆固醇迁移率（Rf）：
胆固醇迁移率（Rf）=胆固醇色斑迁移距离/前沿迁移距离。
数码相机拍照后，利用ImageJ图像处理软件测算胆固醇样品点的灰度值。以胆固醇点样量为横坐标，样品点灰度值为纵坐标，制成标准曲线，并计算回归方程。
2 结果
2.1 胆固醇迁移率（Rf）=胆固醇色斑迁移距离/前沿迁移距离=80 mm/154 mm=0.54
2.2 胆固醇含量标准曲线 回归方程 y=0.5181x+0.0248 R2=0.993
2.3 直接皂化法时间和温度的选择 在相同条件下，选择皂化时间为20、40、60、80 min和皂化温度为50、55、60、65、70 ℃。结果表明，皂化时间60 min和皂化温度65 ℃为最佳实验条件。
2.4 硅胶G薄层层析法样品测定
从市场选购的四种食用植物油及地沟油样品进行测定，结果见图1。
1号层析泳道：胆固醇标准样品（上样量1.25 μg），箭头所指处为胆固醇层析结果；2-5号层析泳道分别为所购大豆油、菜籽油、花生油、调和油油品层析结果；6号层析泳道为地沟油层析结果。
从图1中可以看出，2-6号层析泳道离上样点最近的色斑与1号层析泳道的标准胆固醇色斑位置一致，证明均为胆固醇色斑，6号泳道色斑灰度值明显大于2-5号泳道的色斑，说明各油品经直接皂化法提取的胆固醇中，地沟油样品的胆固醇含量明显高于超市所购食用植物油的胆固醇含量。
3 讨论
本文采用直接皂化法提纯油品中的胆固醇，再通过硅胶G薄层层析法分离测定胆固醇含量，由此得到了满意的效果。此技术的优点在于：实验仪器设备廉价；操作简单、快速，无需过多的专业培训；取样量少，油品经过直接皂化后即可进行测定，简化了操作程序；实验结果可靠，便于基层检验人员开展地沟油筛查工作。（下转第２４４页）
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参考文献
［１］赵玲,潘剑宇,尹平河.潲水油、煎炸老油与合格食用植物油的鉴别研究[J].食品科学,2003(08):27-29.
［２］郭涛,杜蕾蕾,万辉,等.高效液相色谱法测胆固醇含量鉴别地沟油[J].食品科学,2009(22):286-289.
［３］何东平,郭涛,杜蕾蕾.高效液相色谱法测胆固醇含量鉴别地沟油[J].食品科学,2009(22):286-289.
［４］仲维科,许秀丽,任荷玲.氘代同位素内标-气相色谱-质谱法测定胆固醇含量鉴别地沟油的研究[J].检验检疫学刊,2012(02):16-23.
［５］李方实,陈兆圆.地沟油检测方法的研究进展[J].食品研究与开发,2014(08):129-132.
［６］赵年华,彭科怀,廖应萍.直接皂化测定猪肝中胆固醇含量[J]. 预防医学情报杂志,2008(08):663-664.
［７］李伟,王云海,姚秉礼.薄层层析测定胆汁中胆固醇[J].新疆医学院学报,1990(01):59-61.
［责任编辑：杨玉洁］