叶亚新１，杨玲玲１，朱勇良２
（１．苏州科技学院化学生物与材料工程学院，江苏 苏州 ２１５００９；２．江苏省太湖地区农业科学研究所，江苏 苏州 ２１５１５５）
摘要：以萝卜（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）幼苗为材料，研究外源Ｃａ２＋ 对低温胁迫下萝卜幼苗逆境指标可溶性糖、丙二醛（ＭＤＡ）、脯氨酸（Ｐｒｏ）含量、过氧化物酶（ＰＯＤ）和超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性的影响。结果表明，在低温胁迫下，ＭＤＡ、可溶性糖以及Ｐｒｏ的含量明显上升，ＳＯＤ和ＰＯＤ活性先下降再上升。用不同浓度的Ｃａ２＋处理后，可溶性糖和ＭＤＡ的含量相对对照组在处理后的第１天有所下降，而Ｐｒｏ的含量增加，ＰＯＤ和ＳＯＤ的活性变化则与处理的时间有关。用适当浓度的Ｃａ２＋处理可以增强萝卜幼苗对低温的抗性，降低低温对萝卜幼苗的伤害。
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关键词 ：低温胁迫；Ｃａ２＋；逆境指标；萝卜（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）幼苗
中图分类号：Ｓ６３１．１；Q945.78 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０7－1612－０6
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.021
低温对植物的毒害效应，按低温程度和受害情况，可分为冷害和冻害。冷害是指温度在零摄氏度以上时，虽无结冰现象，仍能使喜温植物受害甚至死亡，即零摄氏度以上的低温对植物的伤害。冷害是喜温植物北移的主要障碍，是喜温作物稳产高产的主要限制因子。
近年来发现，低温引发的细胞内Ｃａ２＋水平升高，在抗寒锻炼中起着十分重要的作用。Ｃａ２＋充当低温信号的传递信使，启动抗寒锻炼，诱导抗寒基因的表达［１－４］。利用水母发光蛋白的转基因植物测定Ｃａ２＋浓度等研究揭示和证实，低温条件下由于质膜上电压门控Ｃａ２＋通道的开放而导致了Ｃａ２＋的流入［５］。植物细胞膜感受到低温后，将低温信号通过Ｃａ２＋、ＡＢＡ（脱落酸）等第二信使继续向下游传递，其中Ｃａ２＋是低温信号转导时重要的第二信使［６］。张国增等［７］在研究低温胁迫下拟南芥ＣＢＦ１超表达突变体胞质中Ｃａ２＋浓度的变化时发现，Ｃａ２＋参与了ＣＢＦ１应答低温信号的转导过程，且ＣＢＦ１超表达突变体可能是通过提高胞质Ｃａ２＋的浓度来提高植物的抗低温胁迫能力。由此看来，Ｃａ２＋作为胞内的第二信使在低温胁迫下发挥着调控细胞的重要功能。
Ｃａ２＋不仅在增强植物抵抗非生物逆境时具有重要作用，它在增强植物抗生物逆境如抗病防卫反应中也有重要作用［８］。为此，试验通过测定ＣａＣｌ２处理后萝卜（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）幼苗的丙二醛（ＭＤＡ）、可溶性糖和脯氨酸（Pro）浓度变化以及过氧化物酶（ＰＯＤ）和超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）的活力变化，探讨外源钙离子（Ｃａ２＋）提高植物抵抗低温胁迫以及其他胁迫的积极作用，旨在为进一步研究Ｃａ２＋增强植物抗逆性的机理提供依据。
１ 材料与方法
１．１ 种子来源
富农正宗圆红萝卜，由苏州种子公司提供。
１．２ 萝卜幼苗的培养和试验处理
１．２．１ 萝卜幼苗的培养 将萝卜种子用６０～７０ ℃的去离子水清洗数次，倒去漂浮的种子并将烂种、杂种挑去。淘洗后置于干净的培养皿中待用。将种子播于底部放置湿滤纸的培养皿中，每个培养皿中放一定量的种子，然后在种子上方覆盖１张湿滤纸，加少量的去离子水（半浸没种子），盖好培养皿。最后置于２５ ℃的恒温箱中催芽。等到芽苗长至２～３ ｃｍ时撤掉上方滤纸，置于光照培养室中加完全培养液［９］进行培养，当幼苗茎长至１０ ｃｍ左右时将所有幼苗转移到培养瓶中，瓶壁避光。待幼苗长出第３片真叶时即进行胁迫试验。在萝卜幼苗的水培期间要保证培养液充足，并保持清洁。
１．２．２ 试验处理
１）温度的选择。教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献［１０］和［１１］，确定以５ ℃作为试验的处理温度。
２）试验处理。将萝卜幼苗分组，Ａ——利用完全培养液培养；Ｂ——５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２完全培养液培养；Ｃ——１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２完全培养液培养；Ｄ——１５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２完全培养液培养，置于５ ℃、光照度３３％、白天１４ ｈ、晚上１０ ｈ的恒温培养箱中；另取适量幼苗置于２５ ℃、光照度３３％、白天１４ ｈ、晚上１０ ｈ的恒温培养箱中，作为常温对照，试验期间保证幼苗水培营养液充足。然后在培养１、２、３、４、５ ｄ时分别测定两组幼苗的可溶性糖、ＭＤＡ、Pro含量以及ＰＯＤ和ＳＯＤ活性［１１］。
１．３ 指标测定及方法
可溶性糖、ＭＤＡ、Pro含量，ＰＯＤ、ＳＯＤ活性的测定教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献［９］和［１２］进行。试验数据采用统计软件ＳＰＳＳ １１．０进行分析处理。
２ 结果与分析
２．１ 低温胁迫对萝卜幼苗逆境指标的影响
２．１．１ ５ ℃和２５ ℃下萝卜幼苗叶片中可溶性糖含量的变化 在５ ℃和２５ ℃下分别测得萝卜幼苗叶片中１、２、３、４、５ ｄ后可溶性糖含量的变化如图１所示。从图１可以看出，与对照相比，在低温（５ ℃）条件下时，萝卜幼苗叶片中的可溶性糖含量明显上升。
２．１．２ ５ ℃和２５ ℃下萝卜幼苗叶片中ＭＤＡ含量的变化 在５ ℃和２５ ℃下分别测得萝卜幼苗叶片中１、２、３、４、５ ｄ后ＭＤＡ含量变化如图２所示。从图２可以看出，在低温（５ ℃）条件下时，萝卜幼苗叶片中的ＭＤＡ含量前３ ｄ高于对照，但在处理后的第４、５天低于对照。
２．１．３ ５ ℃和２５ ℃下萝卜幼苗叶片中Ｐｒｏ含量的变化 在５ ℃和２５ ℃下分别测得萝卜幼苗１、２、３、４、５ ｄ后Ｐｒｏ含量的变化如图３所示。从图３可以看出，在低温（５ ℃）条件下时，萝卜幼苗叶片中的Ｐｒｏ含量明显上升，只是在处理后的第１天其Ｐｒｏ含量低于对照。
２．１．４ ５ ℃和２５ ℃下萝卜幼苗叶片中ＰＯＤ活性的变化 在５ ℃和２５ ℃下分别测得萝卜幼苗叶片中１、２、３、４、５ ｄ后ＰＯＤ活性的变化如图４所示。从图４可以看出，与对照相比，在低温（５ ℃）条件下时，萝卜幼苗叶片中的ＰＯＤ活性明显下降，但其活性呈现出随时间延长先上升再下降再上升的趋势。
２．１．５ ５ ℃和２５ ℃下萝卜幼苗叶片中ＳＯＤ活性的变化 在５ ℃和２５ ℃下分别测得萝卜幼苗叶片中１、２、３、４、５ ｄ后ＳＯＤ活性的变化如图５所示。从图５可以看出，与对照相比，在低温（５ ℃）条件下时，萝卜幼苗叶片中的ＳＯＤ活性明显低于对照，其活性呈现出随时间先下降再上升的趋势。
２．２ 不同浓度的Ｃａ２＋处理对低温胁迫下萝卜幼苗逆境指标的影响
２．２．１ 不同浓度的Ｃａ２＋处理对低温胁迫下萝卜幼苗叶片中可溶性糖含量的影响 低温胁迫下导致植物可溶性糖含量发生变化，利用不同浓度的Ｃａ２＋处理后萝卜幼苗叶片内可溶性糖含量的变化如图６所示。由图６可以看出，低温胁迫下只用完全培养液培养萝卜幼苗时，其可溶性糖含量随着时间先下降再上升再下降，而用不同Ｃａ２＋处理后，其可溶性糖的含量在第１天比未经Ｃａ２＋处理的要低，但随着时间的延长，其可溶性糖含量不断增加。但随着Ｃａ２＋浓度的增加，其可溶性糖含量降低，在Ｃａ２＋浓度为１５ ｍｍｏｌ／Ｌ时，可溶性糖含量较其他处理低。
２．２．２ 不同浓度的Ｃａ２＋处理对低温胁迫下萝卜幼苗叶片中ＭＤＡ含量的影响 低温胁迫下导致植物ＭＤＡ含量发生变化，利用不同浓度的Ｃａ２＋处理后萝卜幼苗叶片中ＭＤＡ含量的变化如图７所示。由图７可以看出，低温胁迫下只用完全培养液培养萝卜幼苗时，其ＭＤＡ含量随着时间先下降再上升，但其上升的时间相对滞后。用不同浓度的Ｃａ２＋处理后，其ＭＤＡ的含量在第１天比未经Ｃａ２＋处理的要低，但随着时间的延长，其ＭＤＡ含量比未经Ｃａ２＋处理的要高。Ｃａ２＋浓度为１０ ｍｍｏｌ／Ｌ时，ＭＤＡ含量较其他处理低。
２．２．３ 不同浓度的Ｃａ２＋处理对低温胁迫下萝卜幼苗叶片中Pro含量的影响 低温胁迫下导致植物Pro含量发生变化，利用不同浓度的Ｃａ２＋处理后萝卜幼苗叶片中Pro含量的变化如图８所示。由图８可以看出，低温胁迫下只用完全培养液培养萝卜幼苗时，其Pro含量随着时间的推移逐渐上升，但其上升的幅度较小。用不同Ｃａ２＋处理后，其Pro的含量比未经Ｃａ２＋处理的要高，且随着时间的推移，其Pro含量升高的幅度比未经Ｃａ２＋处理的要大，且呈现先下降再升高的趋势。Ｃａ２＋浓度为５ ｍｍｏｌ／Ｌ时，Pro含量较其他处理低。
２．２．４ 不同浓度的Ｃａ２＋处理对低温胁迫下萝卜幼苗叶片中ＰＯＤ活性的影响 低温胁迫下导致植物ＰＯＤ活性发生变化，利用不同浓度的Ｃａ２＋处理后萝卜幼苗叶片中ＰＯＤ活性的变化如图９所示。由图９可以看出，低温胁迫下只用完全培养液培养萝卜幼苗时，其ＰＯＤ活性随着时间的延长先上升再下降再上升。用不同浓度Ｃａ２＋处理后，其ＰＯＤ活性比未经Ｃａ２＋处理的要低；当Ｃａ２＋浓度大于５ ｍｍｏｌ／Ｌ时，随着时间的推移，其ＰＯＤ的活性整体呈上升趋势。在Ｃａ２＋浓度为５ ｍｍｏｌ／Ｌ时，ＰＯＤ活性较其他处理的要高，当Ｃａ２＋浓度为１５ ｍｍｏｌ／Ｌ时，ＰＯＤ活性较其他处理低。且在处理后的第４天各组（除处理A外）的ＰＯＤ活性达最大值。
２．２．５ 不同浓度的Ｃａ２＋处理对低温胁迫下萝卜幼苗叶片中ＳＯＤ活性的影响 低温胁迫下导致植物ＳＯＤ活性发生变化，利用不同浓度的Ｃａ２＋处理后萝卜幼苗叶片中ＳＯＤ活性的变化如图１０所示。由图１０可以看出，低温胁迫下只用完全培养液培养萝卜幼苗时，其ＳＯＤ活性随着时间的延长先下降再上升。用不同浓度Ｃａ２＋处理后，萝卜幼苗叶片中ＳＯＤ活性基本表现为随着时间的延长先下降再升高。在Ｃａ２＋浓度为１５ ｍｍｏｌ／Ｌ时，ＳＯＤ活性随着时间的延长较其他处理高，在处理后的第４天其ＳＯＤ活性达到最大。
３ 小结与讨论
３．１ Ｃａ２＋对低温胁迫下萝卜幼苗逆境指标的影响
３．１．１ 对低温胁迫下萝卜幼苗叶片中可溶性糖和ＭＤＡ含量的影响 低温伤害不仅破坏植物的细胞代谢，而且导致体内生理功能发生变化，自由基的增加伤害膜系统，引发了细胞膜脂过氧化作用，最终产物ＭＤＡ可以扩散到其他部位［１３］。因此MDA的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系，一定程度上反映了植物受损伤的程度。在对萝卜幼苗进行低温处理时，萝卜幼苗叶片中可溶性糖的含量比常温（２５ ℃）条件下的要高。而萝卜幼苗叶片中ＭＤＡ的含量在低温处理后的前３ ｄ都要比常温条件下的ＭＤＡ含量要高，但随着处理时间的延长，萝卜幼苗叶片中ＭＤＡ含量较常温下要低。究其原因，可能与常温条件下萝卜幼苗大量消耗水分，完全培养液的浓度一定程度上会升高，对萝卜幼苗根部造成了胁迫，导致其ＭＤＡ含量随着处理时间的延长而增加。
萝卜幼苗在经不同浓度Ｃａ２＋处理后的第１天，测得其可溶性糖和ＭＤＡ含量比未经Ｃａ２＋处理的萝卜幼苗要低。即在一定程度上缓解了低温对萝卜幼苗的伤害，但随着处理时间的延长，经Ｃａ２＋处理的萝卜幼苗可溶性糖和ＭＤＡ含量比未经Ｃａ２＋处理的萝卜幼苗要高，猜测出现这一结果可能是因为在低温胁迫下，短时施用外源的Ｃａ２＋可以迅速增加植物细胞内的Ｃａ２＋含量，引发细胞内的信号反应，帮助细胞度过危机。但随着外源Ｃａ２＋处理时间的延长，低温所造成的植物细胞内的渗透胁迫由于额外的钙离子盐进一步加强了其渗透胁迫，因此利用不同浓度的Ｃａ２＋处理后的萝卜幼苗中可溶性糖和ＭＤＡ含量在处理后的第２天开始迅速增加。同时还发现，在利用Ｃａ２＋处理后的第１天，随着Ｃａ２＋浓度的增加，萝卜幼苗所产生的可溶性糖和ＭＤＡ含量越少，也就是萝卜幼苗受低温胁迫程度越小。这也许可以通过低温诱导细胞内Ｃａ２＋增加的时空特征不同来解释，Ｃａｍｐｂｅｌｌ等［１４］利用烟草幼苗在逐步降温的过程中发现，根和植物地上部分表现出敏感性不同，当温度从２５ ℃降到１７～１８ ℃时，引发根细胞质基质Ｃａ２＋水平的升高；当温度进一步降低到１０ ℃时，则在子叶中观察到细胞质基质的Ｃａ２＋增加；当温度降到２ ℃时，根终止了反应，但子叶仍在继续。总之，无论是烟草还是拟南芥，均表现为根在较高温度下发生反应，地上部分则在较低温度下发生反应［１５］。由此可见，出现如此结果不仅与处理时所使用的不同的Ｃａ２＋浓度有关，还与植物自身组织差异有关。
３．１．２ 对低温胁迫下萝卜幼苗叶片中Pro含量的影响 在逆境胁迫下（旱、热、冷、冻），植物可通过积累一定量的溶质降低水势，维持植物体内的水分平衡，保证植物的正常生长。这类物质包括一系列的含氮化合物，如Pro、多胺等，分布最广的是Pro［１６］。Pro积累的原初部位主要是叶，通过两条途径合成，即谷氨酸途径和鸟氨酸途径。Pro在渗透调节方面的作用，一是作为细胞质的渗透调节物质，二是作为防脱水剂。它是无毒的中性溶质，也是水溶性最大的一种氨基酸。在一定的干旱范围内，许多植物是通过渗透调节作用来维持细胞一定的含水量和膨压，从而维持细胞的正常功能。当对萝卜幼苗进行低温处理时，其Pro的含量较常温条件明显升高。利用不同浓度的Ｃａ２＋处理后，各处理萝卜幼苗中的Pro含量比未用Ｃａ２＋处理的要高。从彭志红等［１５］描述的植物Pro的合成途径中发现，Pro的合成并未受Ｃａ２＋信号途径的调节，因此，在这里使用不同浓度的钙盐处理反而加强了萝卜幼苗的渗透胁迫。
３．１．３ 对低温胁迫下萝卜幼苗叶片中ＰＯＤ、ＳＯＤ活性的影响 ＰＯＤ是防止膜脂过氧化的主要酶，在低温胁迫下能够保持膜的完整性。ＳＯＤ的作用是清除超氧自由基，同时产生歧化产物过氧化氢。ＰＯＤ保护酶系统主要起酶促降解过氧化氢的作用，避免因过氧化氢的过量积累导致毒性更大的·ＯＨ-含量增加而对细胞膜产生伤害［１７］。在对萝卜幼苗进行低温处理时，萝卜幼苗的ＰＯＤ活性先上升再下降再上升；萝卜幼苗的ＳＯＤ活性先下降再上升，而无论是ＰＯＤ还是ＳＯＤ的活性总体上都比常温条件下的要低。经过不同浓度的Ｃａ２＋处理后的萝卜幼苗叶片中的ＰＯＤ活性比只进行低温处理的萝卜幼苗叶片中的ＰＯＤ活性要低，在处理的第１天，用５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋处理后的萝卜幼苗ＰＯＤ活性下降得最少。在处理的第１天利用５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋处理后的萝卜幼苗ＳＯＤ活性比只进行低温处理的萝卜幼苗ＳＯＤ活性要高，且处理的第４、５天１５、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋处理萝卜幼苗叶片中ＳＯＤ活性分别达到峰值。
３．２ Ｃａ２＋对低温胁迫下萝卜幼苗逆境指标影响的机制探究
低温对植物组织的伤害大致分为两个步骤：第一步为膜相的改变，膜从液晶态转变为凝胶态，使膜透性剧增；第二步是由于膜损坏而引起代谢紊乱，导致死亡。脂肪酸能直接提高膜的流动性，也能直接影响膜结合酶的活性。在低温胁迫下，ＭＤＡ、可溶性糖和Pro含量都有明显变化［１７］。此外，植物的抗寒性与活性氧代谢关系密切，低温胁迫下植物体内会产生大量的Ｈ２Ｏ２等活性氧自由基，这些活性氧可导致膜脂过氧化，进而造成膜系统的氧化损伤［１８］。而植物体内存在着一系列酶促和非酶促的抗氧化剂以清除活性氧自由基，保护植物细胞免受活性氧的伤害，维持膜系统的稳定性，以增强植株的抗寒力。ＳＯＤ、ＰＯＤ等被认为是清除活性氧过程中最主要的抗氧化酶类，ＳＯＤ的主要功能是清除Ｏ■■·并产生Ｈ２Ｏ２，而ＰＯＤ可以清除体内的Ｈ２Ｏ２，二者协作及时清除自由基，有利于维持植物体内的活性氧代谢平衡，从而使植物能在一定程度上忍耐、减缓或抵抗低温胁迫［１９］。
施用外源Ca2+能减少植物体内有害物质的积累，增加有利物质的合成，提高细胞膜的保护功能，抑制活性氧在植物体内积累，大大提高生物对不良环境的抵抗力，提高植物的抗逆性。对于其机制目前有以下几点猜测：①冷驯化中先启动Ｃａ２＋信使，再通过调节蛋白质磷酸化而诱导与冷相关的基因表达，因而细胞的抗冷性增强；②钙信号通过激活ＣＤＰＫ而活化胁迫诱导的启动子，从而调控相应基因表达；③钙信号通过调节一些蛋白质或酶活性而引发有利于植物适应逆境的生理生化反应，如激活ＣＤＰＫ而调节蛋白磷酸化、通过调节抗氧化酶的活性提高植物的抗氧化性、调节气孔启闭、促进相溶性物质脯氨酸合成、参与离子的选择吸收，以及参与ＡＢＡ的信号转导和植物的交叉保护等［２０］。Ｃａ２＋不仅是大量营养元素，而且是重要的第二信使，调控植物生长发育的很多过程如光形态建成、向地性、细胞分化等。同时质膜的透性和稳定性也与Ｃａ２＋有密切关系。
植物对逆境信号的感受是通过多条信号通路完成的，包括钙信号转导通路、ＡＢＡ信号转导通路、ＭＡＰＫ级联信号通路等，各条通路之间相互交叉、相互影响，共同完成植物对逆境的适应［２１］。其中，钙信号被认为是各个级联信号途径中的交叉节点，而这个网络中有很多过程还没有被阐明。但是随着分子生物学、遗传学等学科的发展和新技术的产生，人们一定会对钙信号的作用进行更深入的研究。
利用ＣａＣｌ２处理的萝卜幼苗虽未避免低温胁迫引起的伤害，但程度已明显减轻，这反映出适当浓度的钙具有增强植物对低温胁迫耐受性的生理作用。但是通过本试验所测得的试验数据发现，这种耐受性加强作用只是在一定的时间范围内的，且利用Ca2+处理对不同的逆境指标的影响不同。例如处理后可溶性糖和ＭＤＡ含量在一定时间范围内有所下降，而Pro的含量却比只进行低温处理的含量要高,这都在一定程度上降低了低温胁迫对植物的伤害。
研究结果表明，在低温胁迫下，萝卜幼苗的可溶性糖、ＭＤＡ以及Pro的含量明显上升，ＰＯＤ和ＳＯＤ活性先下降再上升。低温胁迫下，用１０ ｍｍｏｌ／Ｌ CaCl2处理萝卜幼苗后的第３天，可减少可溶性糖、膜脂过氧化产物ＭＤＡ的积累，但用CaCl2处理后萝卜幼苗Pro的积累增加。当用１０ ｍｍｏｌ／Ｌ的CaCl2和完全培养液处理萝卜幼苗后的第３天，ＳＯＤ活性开始明显上升，而在处理后的第１天和第２天，萝卜幼苗的ＰＯＤ活性比只进行低温处理的要低。这说明适当浓度的Ca2+处理能诱导萝卜幼苗对低温胁迫产生抗性，减轻低温对萝卜幼苗的伤害。
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