马明东，赵银平，赵晓祥
（东华大学环境科学与工程学院，上海 201620）
摘要：采用H－1菌株降解有机磷系阻燃剂磷酸三（2－氯乙基）酯（TCEP），通过单因素试验和正交试验对降解条件进行优化，得到TCEP的最佳生物降解条件：温度为30 ℃、pH为7．0、培养时间为7 d、TCEP初始浓度为20 mg/L，此条件下TCEP的降解率达到最大，为86．00％。其中，温度对TCEP降解的影响最大，其次是TCEP的初始浓度及pH，培养时间的影响最小。
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关键词 ：磷酸三（2－氯乙基）酯（TCEP）；H－1菌株；降解条件；降解率
中图分类号：X172；X703 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2015）06－1341-05
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.016
Optimizing Degradation Conditions of Tris（2－chloroethyl）phosphate
Degrading Bacteria
MA Ming－dong， ZHAO Yin－ping， ZHAO Xiao－xiang
（College of Environmental science and Engineering， Donghua University， Shanghai 201620， China）
Abstract： Strain H－1 was used to degrade tris（2－chloroethyl）phosphate（TCEP） which belonged to organophosphorus flame retardants． The degradation conditions of TCEP were optimized with single factor experiment and orthogonal test． The results showed that the optimal temperature， pH， degradation time and initial concentration of TCEP 30 ℃，pH 7．0， 7 d and 20 mg/L， respectively． Strain H－1 degraded 86．00％ of TCEP under these conditions． Temperature greatly affected the degradation rate of TCEP， followed by pH， the initial concentration of TCEP， and the degradation time．
Key words： tris（2－chloroethyl）phosphate （TCEP）； H－1 strain； degradation conditions；degradation rate
收稿日期：2014－03－14
基金项目：上海市基础研究重点项目（09JC1400600）
作者简介：马明东（1985－），男，老挝万象人，硕士，研究方向为环境微生物学，（电话）15800580847（电子信箱）comsnou@hotmail．com；
通信作者，赵晓祥，研究员，博士，（电话）18916213796（电子信箱）zxx@dhu．edu．cn。
有机磷系阻燃剂中的磷酸酯类（Organophosphate esters，OPEs）具有良好的阻燃性能，与聚合物基材相容性好，耐水、耐热以及耐迁移等特点，常作为电器、家具、纺织等材料中的添加型阻燃剂［1－4］。当前，含OPEs的产品在生产、使用以及废弃回收处理过程中，OPEs极易从这些产品中逃逸挥发并进入周围环境中，继而扩散分布在各种环境介质中。目前，OPEs已是污水中的常见污染物，普遍认为污水处理厂（WWTPs）出水是地表水OPEs的主要来源［5－7］。在没有明显污染源的农业地区，地表水中的OPEs的污染主要源于覆盖温室大棚的塑料薄膜［8］，垃圾渗滤液中的OPEs是地下水甚至海水中OPEs的主要来源［8－10］。随着溴系阻燃剂的禁用和限用，OPEs的产量呈现逐年增加的趋势。由于OPEs具有明显的毒理效应，环境中OPEs污染及风险评估已经成为环境领域的研究热点。磷酸三（2－氯乙基）酯（TCEP）是最常用的一类磷酸酯，被广泛应用于塑料生产行业［11］。目前有机磷系阻燃剂的主要处理方法是物理化学方法，但该方法成本高，易带来二次污染问题。生物降解是消除环境中有机磷系阻燃剂的一种经济有效且无二次污染的方法。本研究采用一株能够以TCEP为唯一碳源的高效降解菌株H－1进行试验，并对其降解条件进行优化，以获得最佳降解效率，为TCEP的生物修复技术提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 试剂 TCEP（97％，百灵威上海分公司），乙酸乙酯（AR，上海凌峰化学试剂有限公司）。
TCEP标准储备液：以乙酸乙酯为溶剂将TCEP配制成浓度为1 000 mg/L的标准溶液。
1．1．2 培养基 无机盐培养基：葡萄糖3 g；（NH4）2SO4 1 g，NaCl 0．2 g，MgSO4·7H2O 0．2 g，CaCl2·2H2O 0．02 g，FeCl2 0．01 g，MnSO4 0．01 g，H2O 1 000 mL，pH 7．0。
富集培养基（LB培养基）：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，H2O 1000 mL，pH 7．0。
分离培养基：LB培养基中加入2％的琼脂。
所有培养基均在121 ℃条件下高压灭菌25 min。
1．1．3 人工生活污水 葡萄糖0．6 g，无水乙酸钠0．8 g，酵母提取物0．3 g，NH4Cl 0．283 g， K2HPO4·3H2O 0．07 g，KH2PO4 0．022 g，H2O 1 000 mL。
1．1．4 仪器 气相色谱—质谱联用仪（GC－MS，7890－5975，美国安捷伦公司），紫外可见分光光度计（UV－1800PC，上海美谱达仪器有限公司），立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），SPH－2102C立式双层摇床（上海世平仪器设备有限公司），DHG－9053A型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂），VS－840－1洁净工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），pH计（上海精科雷磁有限公司）。
1．2 试验方法
1．2．1 菌种的筛选 试验菌种来自上海松东水环境净化有限公司曝气池中的污泥，该厂采用改良式序列间歇反应器（MSBR）工艺，曝气池污泥颜色为黄褐色，沉降性能好，呈絮状结构，pH约为7．0，其MLVSS/MLSS（混合液挥发性悬浮固体浓度/混合液悬浮固体浓度）为0．40。
1）活性污泥的培养。将采集到的活性污泥不间断曝气3 d，静置后去除上清液，然后加入等量配制的人工生活污水，其化学需氧量（COD）约为600 mg/L，按照序批式活性污泥法（SBR）工艺（进水、曝气、静置、排水、闲置）进行培养。培养10 d后，开始向人工生活污水加入适量TCEP，使污水中TCEP浓度为0.001 mg/kg左右，培养1个月。
2）菌种的驯化。取培养后的活性污泥上清液1 mL于100 mL富集培养基中，30 ℃、160 r/min条件下培养。待培养基变浑浊后，取1 mL菌液于100 mL无机盐培养基中，培养基中TCEP的浓度为10 mg/L，使微生物以TCEP为惟一碳源在30℃、160 r/min条件下生长。7 d后，按1％的转接量转接培养液于新的TCEP无机盐培养基中，在相同条件下梯度增加TCEP浓度，驯化培养两个月，TCEP的最终浓度达到70 mg/L。
3）菌种的分离纯化。取驯化后的最后一个周期的菌液适当稀释后均匀涂布于无机盐固体培养基（TCEP浓度为70 mg/L）平板上，于30 ℃恒温培养箱中培养。待培养基上长出菌落后，观察各菌落形态，并挑取形态清晰的单一菌落，于分离培养基上划线分离，反复纯化5～7次后编号标记。
4）菌种的初筛。将分离得到的菌株分别接种于无机盐培养基（TCEP浓度为70 mg/L），于30℃、160 r/min条件下摇床培养，根据培养基的浑浊程度（OD600的大小）来判断菌株利用TCEP的情况。挑选生长相对较旺盛的菌株，分别编号标记。
5）菌种的复筛。将初筛得到的菌株接种于富集培养基中，30 ℃、160 r/min条件下摇床扩大培养后，取适量菌液于6 000 r/min离心10 min，收集菌体并用生理盐水洗涤菌体3次，最后以等体积的生理盐水重悬，即得菌悬液。按2％的接种量将菌悬液接种于无机盐培养基（TCEP浓度为70 mg/L）中，30 ℃、160 r/min条件下恒温摇床培养。降解7 d后采用气相色谱—质谱联用法（GC－MS）测定培养液中TCEP浓度，挑选出降解效果较好的菌株并编号标记。
通过对活性污泥的培养、菌种的驯化、菌种的分离纯化、菌种的初筛和复筛，最终得到7株以TCEP为惟一碳源的降解菌种H－1、H－2、H－3、H－4、H－5、H－6、H－7，并将各个菌种保存于50％的甘油中备用。
1．2．2 菌悬液的制备 取1环保藏于甘油中的菌株直接在分离培养基上划线培养2 d，然后挑取单菌落于富集培养基中培养48 h，最后按照1．2．1中的5）将一定量的新鲜菌液配制成菌悬液备用。
1．2．3 TCEP 降解条件优化 1）单因素试验。本试验选取不同的菌株、温度、pH、时间及TCEP初始浓度这5个因素作为考察对象，分别研究各因素对TCEP降解效果的影响。各试验均以TCEP为惟一碳源进行生物降解，其中试验②③④⑤分别接种H－1菌株的菌悬液，试验①②③⑤中无机盐培养基中TCEP浓度为40 mg/L。①菌株：以2％的接种量将H－1、H－2、H－3、H－4、H－5、H－6、H－7菌株的菌悬液接种到装有100 mL无机盐培养基的250 mL锥形瓶中（后面锥形瓶试验接种方法一致），pH 7．0、160 r/min、30 ℃振荡培养7 d。②温度:分别在20、25、30、35、40、45 ℃温度下，pH 7．0、160 r/min震荡培养7 d。③pH：pH分别为5．0、6．0、6．5、7．0、7．5、8．0、9．0，160 r/min、30 ℃振荡培养7 d。④TCEP初始浓度：TCEP初始浓度分别为5、10、15、20、30、40、60 mg/L的富集培养基，pH 7．0、160 r/min、30 ℃振荡培养7 d。⑤时间：pH 7．0、160 r/min、30 ℃振荡培养9 d。分别测定试验①②③④中第七天时TCEP的降解率，在试验⑤中分别测定1、2、3、4、5、6、7、8、9 d时TCEP的降解率。每个单因素试验设置3个平行，重复2次。
2）正交试验。设置四因素三水平正交试验考察温度、pH、TCEP初始浓度及时间对H－1菌株降解TCEP的影响，因素水平表见表1所示。按照表1所示条件，各组试验均按2％的接种量接种菌株H－1菌悬液，160 r/min、30 ℃摇床培养7 d，测定残余TCEP含量，并计算其降解率。
1．2．4 样品前处理 取降解液10 mL于分液漏斗中，依次用4、4、2 mL乙酸乙酯萃取15 min，合并3次萃取液。将萃取液过无水硫酸钠小柱，然后经0．22 μm孔径的尼龙膜过滤，最后采用GC－MS测定。
1．2．5 TCEP 浓度测定 TCEP浓度采用GC－MS法进行测定，分析条件如下：①气相色谱条件。色谱柱：HP－5（30．0 m×0．25 mm×0．25 μm）；升温程序：初温90 ℃，以10 ℃/min升至230 ℃，保持10 min；载气：高纯氦气，纯度大于99．999％；恒流控制：1．0 mL/min；模式：不分流进样；进样量：1 μL；进样口温度：250 ℃。②质谱条件。离子源：EI，70 eV，温度230 ℃；四极杆温度：150 ℃；接口温度：270 ℃；溶剂延迟时间：5 min；扫描质量范围：m/z 35～350 amu；TCEP的特征峰：11．73 min；特征离子：249，如图1所示。
2 结果与分析
2．1 TCEP标准曲线
准确量取一定量的TCEP标准溶液，用乙酸乙酯配制成浓度为5、10、15、20、40、60、80 mg/L的TCEP溶液。采用GC－MS法分别测定各个浓度的TCEP 溶液，将测得的各浓度溶液相对应的峰面积（y）随TCEP浓度（x）作图，得到TCEP标准曲线，如图2所示。从图中可以看出，TCEP在5～80 mg/L范围内线性关系良好，相关系数r＝0．998 3。标准曲线方程为y＝5×106x－1×107。
2．2 TCEP降解条件优化结果
2．2．1 不同菌株对TCEP降解效果的影响 不同菌株对TCEP的降解效果如图3所示，从图中可以看出7种菌株对TCEP的降解效果各不相同，其中H－1和H－2菌株能够高效降解TCEP，降解率均在78％以上，H－1菌株的降解率高达80．25％。这可能是由于TCEP对其他5种菌株具有一定的抑制作用，导致TCEP利用率的降低。因此，本研究选择菌株H－1作为试验的降解菌株。
2．2．2 培养时间对TCEP降解效果的影响 菌株H－1对TCEP的降解效果随时间的变化如图4所示，从图中可以看出1 d时TCEP的降解率即达64．14％；2~4 d时TCEP的降解率逐渐增大，4 d时降解率高达80．25％；5~7 d时TCEP的降解率缓慢增大，7 d时降解率为82．25％；8~9 d时TCEP基本不降解。因此，本研究选择的TCEP降解时间为7 d。
2．2．3 温度对TCEP降解效果的影响 微生物对TCEP的降解是借助相关酶的催化作用来完成的，而酶的活性只有在一定的温度范围内才能得以发挥［12］，因此温度是影响TCEP降解的关键因素。由图5可以看出，温度对TCEP的降解有较大的影响，菌株H－1在20～45 ℃范围内均可对TCEP进行降解。当温度为20 ℃时， TCEP的降解率为82．35％；随着温度的升高其降解率也随之升高，在25～30 ℃范围内，TCEP的降解速度加快，降解率均高于83．17％，30 ℃时的降解效率达到最大，为83．92％；而当温度超过30 ℃时，TCEP的降解效率反而减小，45 ℃时的降解效率最小，为78．68％。结果表明，温度为30 ℃时菌株H－1对TCEP有较高的降解率，温度过高或过低均不利于微生物对TCEP的降解，特别是当温度高于30 ℃时，可能会引起部分胞外酶的失活，从而导致TCEP降解率的降低。
2．2．4 培养基初始pH对TCEP降解效果的影响 pH是影响微生物生长的一个重要环境因素，大多数异养菌和真菌喜好中性环境，因此pH过高或过低都会影响微生物的降解能力［13］。由图6可以看出，pH为5．0～9．0时，菌株H－1对TCEP均有降解能力；pH为7．0时，TCEP的降解率达到最大，为81．75％；pH高于或低于7．0时，TCEP的降解率明显下降。结果表明，H－1菌株在中性环境时对TCEP的降解效果最好，而环境偏酸或偏碱时，TCEP的降解效果变差。
2．2．5 初始浓度对TCEP降解效果的影响 微生物对污染物的降解率依赖于其自身对污染物的吸收、代谢及污染物的转化程度［14］。污染物的浓度能够影响微生物的活性，浓度过高会抑制微生物的活性，浓度低则不利于污染物的有效降解，但不同化合物产生抑制作用的浓度各不相同，某些情况下高浓度污染物却能够促进微生物的生长繁殖［15］。由图7可以看出，H－1菌株对TCEP的降解率随着TCEP浓度的增加而下降，这可能是由于TCEP对菌株的活性有一定的抑制作用造成的。当TCEP浓度较小时，其降解率较高；随着TCEP浓度的增加，其降解率呈下降趋势；当TCEP浓度超过30 mg/L时，菌株H－1对TCEP的降解率低于83．44％。结果表明，TCEP的初始浓度应控制在30 mg/L以内，此时有利于微生物对TCEP的降解。
2．3 正交试验结果
首先分析因素A各水平对试验指标的影响，A1的影响反映在试验1、2、3中，A2的影响反映在试验4、5、6中，A3的影响反映在试验7、8、9中。由表2可知，kA1、kA2、kA3值均不相等，说明因素A的水平变动对试验结果有影响。在表2中kA2＞kA1＞kA3，所以A2为因素A的优水平。对于因素B、C、D，从表2中可以确定B1、C3、D2分别为因素B、C、D的优水平。四个因素的优水平组合为A2B1C3D2，即培养温度为30 ℃，TCEP初始浓度为20 mg/L，时间为7 d，pH为7．0。
根据极差R的大小，可以判断各因素对试验指标影响的主次。R越大，表示因素的水平变化对试验指标的影响越大，因素越重要。表2中RA＞RD＞RB＞RC，因此各因素对试验指标影响的主次顺序为A、D、B、C，即温度对TCEP的降解影响最大，其次是TCEP初始浓度和pH，时间的影响最小。
3 结论
单因素试验结果表明：培养温度对TCEP的降解有较大影响，30 ℃时其降解率达到最大值83．92％；pH为7．0时，菌株H－1对TCEP有较强的降解效果，而在偏酸或偏碱环境中，其降解效率均不及中性环境；培养降解7 d时，TCEP的降解率达到最大值82．25％，故选择的培养降解时间为7 d；菌株H－1对TCEP的降解率随TCEP浓度的增加而下降，TCEP浓度超过30 mg/L时TCEP的降解率低于83．44％，因此TCEP的初始浓度应控制在30 mg/L以内。
对菌株H－1的降解条件进行四因素三水平正交试验表明：培养温度为30 ℃，TCEP初始浓度为20 mg/L，时间为7 d，pH为7．0是TCEP降解的最佳条件，降解率最大为86．00％；其中温度对TCEP降解率的影响最大，其次是TCEP初始浓度及pH，而时间的影响最小。
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