郭春喜，高宇琼
（铜仁学院生物与农林工程学院，贵州 铜仁 554300）
摘要：优化超声波提取梵净山石斛（Dendrobium fanjingshanense）多糖的最佳工艺条件，可为梵净山石斛多糖的开发应用提供参考。以梵净山石斛为原料，考察料液比（g∶mL）、提取温度、提取时间对梵净山石斛多糖提取率的影响，并采用正交试验对梵净山石斛多糖提取工艺条件进行优化。结果表明，各因素对梵净山石斛多糖提取率的影响顺序为料液比＞提取时间＞提取温度。最佳提取工艺为料液比为1∶35，提取温度为60 ℃，提取时间为40 min。在最佳工艺条件下，超声波对梵净山石斛多糖的提取率为9．83％。
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关键词 ：梵净山石斛（Dendrobium fanjingshanense）；多糖；正交试验；超声波
中图分类号：R284．2；S682．1＋9 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2015）06－1448－04
DOI：10．14088/j．cnki．issn0439－8114．2015．06．042
Optimization of Extracting Polysaccharides from Dendrobium fanjingshanense
with Ultrasonic Method
GUO Chun－xi，GAO Yu－qiong
（College of Biology and A＆F Engineering， Tongren University，Tongren 554300，Guizhou，China）
Abstract： The ultrasonic－assisted extraction of polysaccharides from Dendrobium fanjingshanense was optimized with orthogonal test． The effects of the ratio of material to solution， extraction temperature， extraction time on extracting polysaccharides were studied． The factors affecting the extraction of polysaccharides from Dendrobium fanjingshanense were in the order of the ratio of material to solution ＞ extraction time>extraction temperature． The optimal conditions were the ratio of material to solution of 1∶35（mg∶L）， 60 ℃ and 40 min． Under these conditions，the rate of polysaccharides extracted was 9．83％．
Key words： Dendrobium fanjingshanense； polysaccharides； orthogonal design； ultrasonic wave
收稿日期：2014－12－16
基金项目：贵州省教育厅特色实验室建设项目［黔教合KY字（2011）005］；贵州省教育厅“125”重大科技专项［黔教合重大专项字（2012）018号］
作者简介：郭春喜（1981－），男，山西原平人，讲师，主要从事园林规划设计及园林植物生理生化方面的研究，（电话）18708632384（电子信箱）
guochunxi－2004@163．com。
梵净山石斛（Dendrobium fanjingshanense）为兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium SW．）附生植物，是2001年发现的一个新种［1］，为贵州特有药用植物之一［2］。性味甘淡微咸，寒，归胃、肾，主要用于治疗口干、烦渴、热病伤津、肺热干咳、腰膝软弱、阴伤目暗等病症［3］，其花黄褐色或橙黄色，也可作观赏植物。该植物分布区域狭窄，仅分布在贵州省梵净山黑湾河海拔800～1 500 m处，导致种群数量稀少，不能进行大范围的开发利用。而梵净山石斛组织培育苗的成功，为保护梵净山石斛种质资源及其药用成分的开发与利用提供了有力支撑［4］，为本地区特色药用产业的发展提供了途径。
多糖是具有生物活性的聚合物，有复杂、多方面的生理活性和功能［5］。研究表明，石斛的水溶性多糖能够有效地增强免疫反应，有抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、抗辐射、抗凝血的作用，且对机体毒副作用小［6－9］。因此，针对梵净山石斛多糖的研究，对于开发和利用本地区的特有药用植物资源具有重要意义。
1 材料与方法
1．1 材料与仪器
1．1．1 材料 以贵州省铜仁金农绿色农业科技有限公司培育出的梵净山石斛试管苗，经炼苗后移植成活，栽培3年后的植株为材料，取其茎段为样品。
1．1．2 仪器 AR124CN型电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；101－3型电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；SG5200HPT型台式超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）；80－2型离心沉淀机（江苏金坛市中大仪器厂）；SHZ－D（Ⅲ）型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；HH－S6型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；T6新世纪型紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。
1．1．3 试剂 葡萄糖标准品；苯酚、浓硫酸、乙醇、正丁醇、氯仿均为国产分析纯。
1．2 试验方法
1．2．1 葡萄糖标准曲线的制备 蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1．000 g溶于50 mL乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，置于黑暗中保存。标准品溶液的制备：精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖标准品0．100 g，加去离子水溶解后用100 mL容量瓶定容，即得1 mg/mL的葡萄糖标准品液。标准曲线的制备：精密量取标准品液0．0、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2、1．4 mL于具塞试管中，分别加去离子水至2．0 mL，各加入0．5 mL 蒽酮乙酸乙酯溶液，迅速加入5．0 mL浓硫酸，振荡摇匀，置于沸水浴10 min，取出迅速冷却至室温，以2．0 mL去离子水代替葡萄糖液为对照，在630 nm处测定吸光度。分别以质量浓度（C）、吸光度（A）为横、纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：A＝ 1．551 4C＋0．000 3，R2＝0．999 4。
1．2．2 梵净山石斛多糖含量的测定 将梵净山石斛清洗干净，研碎后60 ℃烘干、继续粉碎得梵净山石斛粗粉。称取梵净山石斛粗粉50 g，经石油醚脱脂，在超声波功率为80 W时提取多糖，抽滤，用无水乙醇沉淀24 h，以4 000 r/min离心20 min，去上清液，得到粗多糖。加入0．5 mL 蒽酮乙酸乙酯溶液，再加入5．0 mL浓硫酸，置于沸水浴10 min，冷却至室温，然后按照蒽酮－硫酸法测定吸光度。按以下公式计算多糖提取率：
多糖提取率＝［（A－0．000 3）/1．551 4×D×V/M］×100％
式中，A为吸光度；D为样品液的稀释倍数；V为浸提液的体积（mL）；M为取样的质量（g）。
1．2．3 单因素试验 以料液比（g∶mL，下同）分别为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，比较不同料液比对梵净山石斛多糖提取率的影响；提取时间分别为20、30、40、50、60 min，比较不同超声波时间对梵净山石斛多糖提取率的影响；提取温度分别为40、50、60、70、80 ℃，比较不同提取温度对梵净山石斛多糖提取率的影响。
1．2．4 正交试验 为优化梵净山石斛多糖的提取条件，本试验以料液比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）为影响因素，选用L9（34）正交设计进行试验，用蒽酮－硫酸法测定多糖含量，并计算提取率。
数据用Microsoft Excel 2010和spss 17．0处理。
2 结果与分析
2．1 单因素试验结果
2．1．1 料液比对梵净山石斛多糖提取率的影响 准确称取5份梵净山石斛粗粉各0．500 0 g，按照单因素试验设计的不同料液比，在提取温度为60 ℃，超声波时间为40 min的条件下， 比较不同料液比对梵净山石斛多糖提取率的影响。每个料液比水平做3次重复试验后取平均值，结果见图1。由图1可知， 梵净山石斛多糖提取率随着料液比的降低呈先升高后降低的趋势。当溶剂不断地增加时， 多糖的溶解量会随之增大，因此，随着料液比降低多糖提取率也会增大。当料液比为1∶30时， 梵净山石斛多糖提取率达到最大。但当梵净山石斛组织细胞内外多糖浓度达到近似平衡时， 即溶剂中的多糖含量上升到一定值时， 细胞内的多糖不易溶解出，从而抑制了多糖提取率的增加。综合考虑试验结果和方差分析结果， 从实际生产的操作性来说，确定超声波提取梵净山石斛多糖的料液比为1∶30或1∶35均可。
2．1．2 提取时间对梵净山石斛多糖提取率的影响 准确称取5份梵净山石斛粗粉各0．500 0 g，按照单因素试验设计的不同提取时间，在料液比为1∶30，提取温度为60 ℃的条件下，比较不同提取时间对梵净山石斛多糖提取率的影响。每个提取时间做3次重复试验后取平均值，结果见图3。由图3可知，梵净山石斛多糖提取率随着提取时间的增加呈先升高后降低的趋势。当提取时间为40 min时，梵净山石斛多糖提取率达到最大。提取时间太短不利于多糖的溶出，提取时间太长导致多糖分解和大量杂质的溶出，进而降低了多糖提取率。在提取时间为40 min时，超声波对细胞的破碎作用达到最强，利于多糖的溶出，导致提取率最高。综合考虑方差分析结果，从实际生产中的可操作性方面来说，以30 min或40 min的提取时间均可。
2．1．3 提取温度对梵净山石斛多糖提取率的影响 准确称取5份梵净山石斛粗粉0．500 0 g，按照单因素试验设计的不同提取温度，在料液比为1∶30，超声时间为40 min的条件下，比较不同提取温度对梵净山石斛多糖提取率的影响。每个提取温度水平做3次重复试验后取平均值，结果见图4。由图4可知，梵净山石斛多糖提取率随着提取温度的升高呈先升高后降低的趋势。当提取温度为50 ℃时，梵净山石斛多糖提取率达到最大。这可能因为适当地增加液温可以促进多糖的溶出，利于多糖提取。但随着液温的上升，过高的提取温度会破坏多糖的结构，使部分多糖发生降解而影响其活性［10］。再者，高温导致液体中生存的气泡会遮挡超声波，使超声波减弱，从而使提取率降低。综合考虑试验和方差分析结果，在实际生产中以50 ℃或60 ℃作为梵净山石斛多糖的提取温度均可。
2．2 正交试验
根据单因素试验结果，多糖提取优化试验的3个因素水平见表1。多糖提取率结果见表2。由极差分析可知，各因素对梵净山石斛多糖提取率的影响主次顺序为A＞C＞B，即料液比＞提取时间＞提取温度。方差分析结果见表3。由表3可知，料液比的F＞F0．05，即P＜0．05，说明不同水平的料液比对多糖提取率的影响显著，料液比为1∶35时提取效果最好；提取时间的F＞F0．05，即P＜0．05，说明不同水平的提取时间对多糖提取率的影响显著，提取时间为40 min时提取效果最好；提取温度对多糖提取率的影响不显著。因此，梵净山石斛多糖最佳提取条件为A3B3C2，即料液比为1∶35，提取温度为60 ℃，提取时间为40 min。实际生产中，考虑提取温度对多糖影响不大，且高温会增加能耗和成本投入，因此提取温度为40～60 ℃均可。在正交试验中得到的最佳提取工艺条件下重复3次进行验证试验，测得提取率的平均值为9．83％，高于正交试验中的最高提取率9．78％，表明通过正交试验优化了提取工艺，所得到的工艺稳定、可靠。
3 小结与讨论
对于石斛属的多糖提取工艺研究中，大部分采用热水浸提法、乙醇回流法等［11－13］，这类工艺有提取时间较长、提取温度较高、提取率较低的缺点。本研究采用的超声波辅助提取法具有提取温度低、提取时间较短、提取率较高，且产品纯化容易等优点，更适合应用于石斛属植物的多糖提取［14］。
以梵净山石斛为材料，采用超声波法提取多糖，通过单因素试验和正交试验优化多糖提取工艺。由正交试验极差分析可知，各因素对多糖提取率的影响依次为料液比＞提取时间＞提取温度，料液比、提取时间对多糖提取的影响显著，提取温度对多糖提取率的影响不显著。超声波提取梵净山石斛多糖的最佳工艺为料液比1∶35，提取温度60 ℃，提取时间为40 min。在最佳提取工艺条件下进行验证性试验，梵净山石斛多糖提取率平均值为9．83％。说明优化后的提取工艺稳定、可行。本研究可为梵净山石斛药用资源的开发利用提供参考。
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参考文献：
［1］ 金效华，张玉武，肖丽萍．中国石斛属一新种［J］．植物分类学报，2001，39（3）：269－271．
［2］ 孙济平，何顺志．贵州特有药用植物的种类及分布［J］．中国中药杂志，2005，30（10）：735－738．
［3］ 徐文芬，黄 敏，何顺志．贵州兰科药用植物新资源调查［J］．贵州农业科学，2012，40（8）：18－21．
［4］ 铜仁网．梵净山石斛组培在碧江区获得成功［DB/OL］．http：//www．tongren．gov．cn/html/2012/1104/shehui24640．html，2012－11－04．
［5］ 刘 莉，萧凤回．石斛属药用植物多糖研究进展［J］．现代中药研究与实践，2009，23（1）：77－80．
［6］ 季宇彬．中药多糖的化学与药理［M］．北京：人民卫生出版社，2005．
［7］ 汪志好．植物多糖的研究进展［J］．安徽卫生职业技术学院学报，2007，6（2）：86－88．
［8］ 罗慧玲，蔡体育，陈巧伦，等．石斛多糖增强脐带血和肿瘤病人外周血LAK细胞体外杀伤作用的研究［J］．癌症，2000，19（12）：1124．
［9］ 林 萍，毕志明，徐 红，等．石斛属植物药理活性研究进展［J］．中国药事，2005，19（7）：445．
［10］ 张 颖，李敏杰，杨 舸．攀枝花余甘子多糖的提取研究［J］．湖北农业科学，2011，50（12）：2523－2525．
［11］ 何铁光，杨丽涛，李杨瑞，等．铁皮石斛原球茎多糖提取最佳工艺研究［J］．西北农业学报，2006，15（5）：240－243．
［12］ 李 强，谢 扬，丁宗保，等．正交设计优选黄石斛多糖提取工艺［J］．安徽农业科学，2010，38（28）：15608－15609．
［13］ 赵福全，白 音，张玉兰．马鞭石斛多糖提取工艺的初步研究［J］．内蒙古民族大学学报（自然科学版），2009，24（2）：188－192．
［14］ 刘石泉，赵云林，徐 玲，等．疏花石斛中石斛多糖的提取工艺［J］．中国实验方剂学杂志，2011，17（1）：5－8．