吴远志
（华中农业大学生命科学技术学院，武汉 ４３００７０）
摘要：运用基因工程技术将外源抗病基因直接导入具有优良农艺性状的小麦品种中，能够获得抗赤霉病小麦新品种。采用基因枪介导的共转化法，以ｂａｒ基因为筛选标记，将几丁质酶基因导入长江中下游小麦栽培品种郑麦９０２３，Ｔ０代经过ＰＣＲ鉴定，获得６株阳性植株，表明几丁质酶基因已整合到小麦基因组中。
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关键词 ：小麦；赤霉病；基因枪转化；几丁质酶基因
中图分类号：Ｓ５１２．１；Ｑ７８５ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０５－１０３８－０４
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０５．００４
收稿日期：２０１４－０６－１６
作者简介：吴远志（１９８７－），男，湖北黄石人，在读硕士研究生，研究方向为植物基因工程，（电话）１５５２７９７０８７３（电子信箱）６２３６１８７７６＠ｑｑ．ｃｏｍ。
小麦赤霉病（Ｆｕｓａｒｉｕｍ Ｈｅａｄ Ｂｌｉｇｈｔ，ＦＨＢ）是由禾谷镰刀菌引起的禾谷类真菌病害，其致病菌主要在开花灌浆期侵染小麦的穗部，造成穗腐、粒腐，引起减产，甚至颗粒无收。禾谷镰刀菌在侵染小麦的过程中会产生单端孢霉烯族毒素（Tｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ，单族毒素），会滞留在子粒上进入食物链，从而引起食品安全问题，危及人畜健康，近年来随着气候的变暖，小麦赤霉病在北美和欧洲大陆也时有大面积发生，这严重影响着小麦生产区的粮食安全。
可是，到目前为止，世界上还没有发现完全抗赤霉病的小麦品种，抗赤霉病育种工作已经开展了很多年，主要集中在传统育种方面［1］，但是传统育种耗时费力，获得的小麦品种抗性单一，抗性遗传基础狭窄［2］，利用转基因技术将赤霉病抗性基因转入小麦栽培品种，丰富小麦中的抗真菌性病害基因，加快育种进程，大大提高育种效率和抗病效果，不失为一种有效获得抗性小麦品种的重要途径。
研究表明，几丁质是一种广泛分布于多数真菌细胞壁上的主要成分。它是Ｎ－乙酰－Ｄ－葡萄糖胺以β－１，４－糖苷键连接的多聚物。植物中的Ｎ－乙酰葡萄糖胺以糖酯键形式存在，而非线性同聚物，即植物中缺少该酶的有效底物。所以几丁质酶可以降解病原真菌细胞壁中的几丁质，破坏细胞新物质的沉积致使病原体死亡，而且产生的细胞壁碎片具有诱导作用，从而刺激寄主植物的抗病反应。通过基因工程的手段将几丁质酶基因转入小麦中，使小麦获得分泌几丁质酶（Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）的能力。当禾谷镰刀菌入侵小麦时，转基因小麦分泌的几丁质酶可将此真菌的细胞壁分解，抑制真菌的侵染和繁殖，从而达到抗病的效果。
１９９２年Ｖａｓｉｌ等［3］采用基因枪技术获得了第一株转基因小麦，随后，Ｗｅｅｋｓ等［4］利用基因枪技术将 ｇｕｓ和ｂａｒ基因导入了小麦，建立基因枪转化小麦的技术体系。目前，基因枪转化体系日益成熟，在小麦遗传转化方法中起着举足轻重的作用［5，6］。基因枪法与其他转化方法相比，具有许多优点：受体材料来源广泛，无宿主限制，它避免了原生质体培养再生植株困难的问题以及农杆菌的宿主范围限制；具有可控性高、操作简便、快速、灵活等特点，从而实现多基因共转化［7］。到目前为止，基因枪法运用最小表达框进行小麦遗传转化成为应用最为广泛的方法［8－１1］。
本研究采用基因枪共转化的方法，利用ｂａｒ基因作为筛选标记基因，将含有几丁质酶基因用于基因枪转化，以期获得含有几丁质酶基因的转基因小麦，并探索利用几丁质酶基因改良小麦抗赤霉病性状的可行性，对小麦提高赤霉病抗性研究具有重要意义。
１ 材料与方法
１．１ 材料
试验所用小麦品种郑麦为９０２３，质粒为ｐＸＪＣ－ ｃｈ４２、ｐＢａｒ。
１．２ 试验方法
１．２．１ 培养基配制 培养基成分教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献［12］。
１．２．２ 外植体选择 取开花后１２～１４ ｄ的麦穗，剥取麦穗中间部位比较饱满的体被白色绒毛呈嫩绿色的未成熟幼胚，用７０％乙醇消毒３０ ｓ，无菌水快速冲洗１次，０．１％氯化汞消毒６～８ ｍｉｎ，无菌水冲洗３～５次，每次２ ｍｉｎ；在无菌条件下剥取半透明状的幼胚，接种于愈伤诱导培养基中，放于２７ ℃培养后用于转化，挑选呈淡黄色，颗粒状，较致密的愈伤转至高渗培养基作高渗处理。
１．２．３ 基因枪轰击方法与参数 利用Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司生产的ＰＤＳ－１０００型高压氦气基因枪。轰击参数：压力7.58 Mpa，距离 ９ ｃｍ，真空度93.13 kPa，轰击次数１次，每枪金粉用量为２５０ μｇ，ＤＮＡ用量为 １．５ μｇ，根据Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司基因枪使用说明书提供的方法轰击，轰击后继续高渗暗处理１６ ｈ。
１．２．４ 恢复培养及筛选 轰击后的愈伤继续高渗 １６～２０ ｈ，然后转入恢复培养基于 ２７ ℃中培养，根据愈伤组织在恢复培养基上生长的状态，愈伤组织快速增殖开始出现大量胚状体的时候，即可转入分化筛选培养基。将恢复后的胚性愈伤组织转入分化筛选培养基，待愈伤分化出抗性绿芽后转入再生筛选培养基，将生长状态良好的绿苗转入生根筛选培养基。将生根筛选后存活的苗转入壮苗培养基中壮苗，随时观察苗的状态。当幼苗明显变绿，根系较发达时即可置于４ ℃春化，移栽至温室。
１．２．５ 转基因植株的ＰＣＲ检测 用ＣＴＡＢ法提取小麦幼嫩叶片基因组ＤＮＡ。对目的基因进行ＰＣＲ检测。以ｄｄ Ｈ２Ｏ和未转化的同一品种植株ＤＮＡ作阴性对照进行ＰＣＲ扩增，可以扩增出４０８ ｂｐ的特异性片段。ＰＣＲ仪为ＭＪ－１００型，反应条件为：９５ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性４０ ｓ，６１ ℃退火４０ ｓ，７２ ℃延伸４０ ｓ，３５个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ，１０ ℃１０ ｍｉｎ终止反应。
２ 结果与分析
２．１ 小麦转ｂａｒ基因植株筛选
取开花后１２～１４ ｄ的麦穗，剥取麦穗中间部位比较饱满的体被白色绒毛呈嫩绿色的未成熟幼胚（图１Ａ），在无菌条件下剥取半透明状的幼胚，接种于愈伤诱导培养基中（图１Ｂ），挑选呈淡黄色，颗粒状，较致密的愈伤转至高渗培养基，置于小皿中央的圆圈内高渗处理４～６ ｈ（图１Ｃ），轰击后的愈伤继续高渗 １６～２０ ｈ，然后转入恢复培养基于 ２７ ℃培养（图１Ｄ），恢复培养后愈伤组织快速增殖出现大量胚状体（图１Ｅ），将恢复后的胚性愈伤组织转入分化筛选培养基分化筛选 （图１Ｆ），分化筛选后愈伤分化出绿点（图１Ｇ），将长出的绿苗分成单株，转入生根筛选培养基筛选，得到部分抗性组培苗（图１Ｈ），将生根筛选后存活的苗转入壮苗培养基中，随时观察苗的状态。当幼苗明显变绿，根系较发达时即可置于４ ℃春化，移栽至温室（图１Ｉ）。
２．２ 转基因植株的ＰＣＲ鉴定
取郑麦９０２３ Ｔ０代植株的幼嫩叶片，用ＣＴＡＢ 法提取小麦叶片ＤＮＡ，用几丁质酶基因的特异引物ＬＩ／ＵＥＲ对抗性植株进行ＰＣＲ鉴定，郑麦９０２３在Ｔ０代获得６株阳性植株（表１，图２），表明几丁质酶基因已整合到小麦基因组中。
３ 小结与讨论
几丁质又称壳多糖，是由Ｎ－乙酰葡萄糖胺通过β连接聚合而成的结构同多糖。广泛存在于自然界中，是真菌类细胞壁的主要成分。通过基因工程的手段将几丁质酶基因转入小麦中，使小麦获得分泌几丁质酶（Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）的能力。当禾谷镰刀菌入侵小麦时，转基因小麦分泌的几丁质酶可将此真菌的细胞壁分解，抑制真菌的侵染和繁殖，从而达到抗病的效果。在本研究中，几丁质酶基因具有广谱抗菌功能，能抑制十几种病原菌和非病原真菌的生长及孢子萌发，其几丁质结合区对细胞壁的高亲和力导致其强烈的抑菌效果。Ｔ０代经ＰＣＲ鉴定，获得６株阳性植株，表明几丁质酶基因已经整合到小麦基因组中。
ｂａｒ基因是从吸水链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）中分离出来的，编码膦丝菌素乙酰转移酶（Ｐｈｏｓｐｈｉｎｉｔｈｒｉｃｉｎ ａｃｅｔｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＰＡＴ），ＰＡＴ能够催化ＰＰＴ的游离氨基乙酰化，乙酰化的ＰＰＴ无法抑制ＧＳ活性，从而对ＰＰＴ起到解毒作用［１3］。含有ｂａｒ基因的植物具有对Ｂｉａｌａｐｈｏｓ的抗性，因此，ｂａｒ基因可作为选择性标记基因，利用其在转化植物体内中的表达，只要在筛选培养基中加入一定剂量的 Ｂｉａｌａｐｈｏｓ，就会杀死非转化细胞，而生存下来的就是含有标记基因的转化细胞。在Ｂｉａｌａｐｈｏｓ筛选体系获得抗性植株１６４株，经ＰＣＲ鉴定，Ｔ０代才获得转基因小麦植株６株。这种在Ｂｉａｌａｐｈｏｓ筛选体系下抗性苗多而阳性苗少的现象，可能是由于植物细胞本身具有一定的耐受性和抗逆性，非转化细胞即使在高浓度的筛选剂筛选中也出现逃逸现象，产生假转化体，还有可能是由于某些转化组织的解毒能力很强，能够使最接近的非转化组织得到交叉保护［１4］。
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参考文献：
［1］ 吴兆苏，沈秋泉，陆维忠，等．小麦抗赤霉病基因库的建拓［Ｊ］．作物学报，１９８４，10（2）：７３－８０.
［2］ 宋凤英，李兰芬，陈立君，等．小麦赤霉病的抗性改良研究进展［Ｊ］．黑龙江农业科学，２００５（３）：４１－４４.
［3］ ＶＡＳＩＬ Ｖ， ＣＡＳＴＩＬＬＯ Ａ Ｍ， ＦＲＯＭＭ Ｍ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｆｅｒｔｉｌｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｗｈｅａｔ ｐｌａｎｔｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｇｅｎｅｒａｂｌｅ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ［Ｊ］． Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９２， １０： ６６７－６７４.
［4］ ＷＥＥＫＳ Ｊ Ｔ， ＡＮＤＥＲＳＯＮ Ｏ Ｄ， ＢＬＥＣＨＬ Ａ Ｅ． Ｒａｐｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｌｉｎｅｓ ｏｆ ｆｅｒｔｉｌｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｗｈｅａｔ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９３， １０２： １０７７－１０８４.
［5］ ＶＡＳＩＬ Ｉ Ｋ， ＶＡＳＩＬ Ｖ． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｖｉａ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ［Ｊ］． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００６， ３１８： ２７３－２８３.
［6］ ＶＡＳＩＬ Ｉ Ｋ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｒｅａｌｓ： Tｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｗｈｅａｔ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｓｅｔｉｖｕｍ Ｌ．）［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ， ２００７， ２６（８）：１１３３－１１５４．
［7］ ＲＯＭＡＮＯ Ａ， ＲＡＥＭＡＫＥＲＳ Ｋ， ＢＥＲＮＡＲＤＩ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｏｔａｔｏ ａｆｔｅｒ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ［Ｊ］． Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ， ２００３， １２： ４６１－４７３．
［8］ ＶＩＤＡＬ Ｊ， ＫＩＫＫＥＲＴ Ｊ， ＤＯＮＺＥＬＬＩ Ｂ． Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｕｓｉｎｇ ｍｉｎｉｍａｌ ｇｅｎｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ， ２００６， ２５： ８０７－８１４．
［9］ ＺＨＡＯ Ｙ， ＱＩＡＮ Ｑ， ＷＡＮＧ Ｈ Ｚ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ｖｉａ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｓａｆｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｎｙ ｕｎｗａｎｔｅｄ ＤＮＡ［Ｊ］． Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｐｌａｎｔ，２００７，４３： ３２８－３３４．
［１0］ ＹＡＯ Ｑ， ＣＯＮＧ Ｌ， ＨＥ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ２００７， ３４： ６１－６７．
［１1］ ＧＵＩＲＩＭＡＮＤ Ｇ， ＢＵＲＬＡＴ Ｖ， ＯＵＤＩＮ Ａ． Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｂｕｔｅｎｙｌ ４－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｎｄ ｇｅｒａｎｉｏｌ １０－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ， ２００９， ２８：１２１５－１２３４．
［１2］ ＬＩＵ Ｚ Ｗ， ＬＩ Ｈ Ｐ， ＣＨＥＮＧ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｏｖｅｒａｌｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｂｌｉｇｈｔ ａｎｄ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅａｄ ｂｌｉｇｈｔ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｗｈｅａｔ ｂｙ ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ｆｕｎｇａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ［Ｊ］． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ２０１２， １３４： ７２１－７３２．
［１3］ ＴＨＯＭＰＳＯＮ Ｃ Ｊ， ＭＯＶＶＡ Ｎ Ｒ， ＴＩＺＡＲＤ Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｂａｒ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ［Ｊ］． ＥＭＢＪ， １９８７， ６： ２５１９－２５２３．
［１4］ ＣＨＲＩＳＴＯＵ Ｐ， ＦＯＲＤ Ｔ Ｌ， ＫＯＦＯＲＮ Ｍ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） ｐｌａｎｔｓ ｆｒｏｍ ａｇｒｏｎｏｍｉｃａｌｌｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ｉｎｄｉｃａ ａｎｄ Ｊａｐｏｎｉｃａ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｖｉａ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｄｉｓｃｈａｒｇｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ＤＮＡ ｉｎｔｏ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｚｙｇｏｔｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｓ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ， １９９１， ９： ９５７－９６２.