程 华１，陈小玲１，李琳玲１，程军勇２，邓先珍２，张雪花１，黄兵杰１，程水源１
（１．黄冈师范学院生命科学学院／经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室，湖北 黄冈 ４３８０００；
２． 湖北省林业科学研究院，武汉 ４３００７５）
摘要：分别采集湖北省罗田县、麻城市自然分布的２８、８株罗田甜柿（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ ｋａｋｉ Ｔｈｕｎｂ ｃｖ． Ｏｒｉｅｎｔａｌ ｐｅｒｓｉｍｍｏｎ）古树优系及小涩柿、无核、宝盖、秋焰甜柿优系为研究材料，利用简单重复序列间扩增分子标记（Ｉｎｔｅｒ ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ，ＩＳＳＲ）技术对４０个甜柿优系进行初步认证及亲缘关系分析。结果表明：①从２１条ＩＳＳＲ引物中筛选出了９条能够扩增出清晰、稳定条带的引物，９条引物共扩增出１８５条谱带，其中多态性条带有１８５条，多态性条带比率为１００％；②应用ＮＴＳＹＳ２．１０ｅ软件对扩增结果进行非加权组平均法（Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ ｐａｉｒ－ｇｒｏｕｐ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ ｍｅａｎｓ，ＵＰＧＭＡ）聚类分析，４０个甜柿优系大致被分为两大类，遗传相似系数从０．３９到０．９２；③罗田甜柿古树基因资源丰富，每个基因型都有其独特的指纹图谱，遗传多样性高。罗田甜柿优系间的亲缘关系与地理来源有一定的相关性，麻城市与罗田县地理位置交界区域的罗田甜柿资源相对集中在Ａ区，其他地理位置采集优系集中在Ｂ区。分析结果可为罗田甜柿种质资源开发、基因资源保存、后期品种审定及鉴别提供理论依据。
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关键词 ：罗田甜柿（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ ｋａｋｉ Ｔｈｕｎｂ ｃｖ． Ｏｒｉｅｎｔａｌ ｐｅｒｓｉｍｍｏｎ）；简单重复序列间扩增分子标记；种质资源；鉴定
中图分类号：Ｓ６６５．２；Ｑ７５；Ｓ６０２．４ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）02－0370-07
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ ０４３９－８１１４．２０１5．02．０29
柿（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ ｋａｋｉ Ｔｈｕｎｂ）是我国五大木本粮油树种之一，其果实、果蒂和叶片富含维生素Ｃ、多糖、碘、单宁等营养成分［１］，可广泛应用于食品、药品、饮料等工业领域。作为世界上惟一自然脱涩的甜柿品种罗田甜柿（Ｄ． ｋａｋｉ ｃｖ． Ｏｒｉｅｎｔａｌ ｐｅｒｓｉｍｍｏｎ）在湖北省罗田县已有千余年的栽培历史。现在罗田甜柿是中国地理标志产品，种植面积已发展到０．２４万ｈｍ２，年产甜柿０．６万ｔ，鲜果收入达１．４４亿元，是罗田县极具发展潜力的木本粮油产业之一［２］。
柿种内的变异极为丰富，芽变品种多，所以品种间的亲缘关系不明析，严重影响了柿资源的推广、育种亲本的选配和栽培立地条件的选择［３］。由于传统的植物形态鉴定存在时效性较差、容易受到环境与主观因素的影响等特点，难以进一步弄清罗田甜柿种质资源的亲缘关系。因此，利用分子标记技术结合形态鉴定手段是理顺罗田甜柿亲缘关系的有效途径。简单重复序列间扩增（Ｉｎｔｅｒ ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ，ＩＳＳＲ）分子标记是类似随机扩增多态性ＤＮＡ（Ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ，ＲＡＰＤ）标记的一种聚合酶链式反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技术［４］，是近几年来在微卫星（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）分子标记基础上发展起来的一种新型分子标记技术［５］；ＩＳＳＲ标记能有效揭示种群内的遗传多样性，进而分析其系统分化规律，研究群体遗传结构及其多样性程度［６］。然而ＩＳＳＲ技术极易受模板、引物以及Ｔａｑ酶等因素的影响，任何一个因素的改变都可能使扩增产物发生变化。为此需要对甜柿ＩＳＳＲ分子标记的反应体系进行优化，使反应结果更加精准。试验选用ＩＳＳＲ技术探讨了罗田甜柿古老优树种质资源的基本情况，以期能够更快速、准确、简便地鉴定这些古老优树间的亲缘关系，从分子学水平上为罗田甜柿种质资源的收集、鉴定和发展利用提供参考依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 材料 罗田甜柿植物材料为湖北省罗田县不同乡镇的古老优树２８个样品，以麻城市不同乡镇的８个样品作为参照，用罗田县农家品种无核（W）、宝盖（B）、小涩柿（S）、秋焰（Q）为筛选引物提供参考。每个样品随机选取１０～２０片幼嫩叶片，田间采叶后装入做好标记的自封袋中，迅速送到黄冈师范学院经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室，于－８０ ℃冰箱中冷冻保存。材料来源和编号见表１。
１．１．２ 主要试剂 琼脂糖、５×ＴＢＥ缓冲液、２×Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ购自北京天根生化科技有限公司；ＣＴＡＢ提取ＤＮＡ试剂、３０％聚丙烯酰胺、过硫酸胺、ＴＥＭＥＤ、硝酸银、氢氧化钠、甲醛、无水乙醇、冰醋酸等购自武汉贝尔生物技术有限公司；Ｍａｋｅｒ ＤＬ２０００购自大连宝生物工程有限公司。
１．２ 方法
１．２．１ 罗田甜柿基因组ＤＮＡ的提取与检测 试验参考梁玉琴等［７］的ＣＴＡＢ法，略做改进，提取４０个罗田甜柿优系叶片的总基因组ＤＮＡ。在０．８ ％的琼脂糖凝胶电泳中检测所提取基因组ＤＮＡ的质量，紫外分光光度计检测ＤＮＡ的浓度，提取的总ＤＮＡ保存于－２０ ℃冰箱中，备用，－４ ℃为短期存放条件。
１．２．２ 引物来源及ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增反应体系的建立 试验所用引物是依据柿的ＥＳＴ文库筛选出的ＩＳＳＲ序列，参照加拿大哥伦比亚大学网站公布的ＩＳＳＲ引物序列，共设计出２１条扩增引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增反应体系为２０ μＬ，包括２×Ｔａｑ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ反应液（０．１ Ｕ／μＬ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、５００ μｍｏｌ ｄＮＴＰ ｅａｃｈ、２０ ｍｍｏｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ ｍｍｏｌ ＫＣｌ、３ ｍｍｏｌ ＭｇＣｌ２ 及其他稳定剂和增强剂）１０ μＬ，引物２ μＬ，ＤＮＡ模板５０ ｎｇ，ｄｄＨ２Ｏ 加至２０ μＬ。扩增程序设为９４ ℃预变性３ ｍｉｎ；然后９４ ℃变性３０ ｓ，５０～５６ ℃退火４０ ｓ，７２ ℃ ３ ｍｉｎ，共３５个循环；最后７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。
１．２．３ 引物筛选 选用基因组ＤＮＡ纯度较高的罗田甜柿样品为模板，分别对２１个引物采用以上扩增程序进行ＰＣＲ扩增。扩增产物先用１％的琼脂糖凝胶电泳初步检测，再用６％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步分析，筛选出的多态性较高的引物用于４０个罗田甜柿样品的鉴定。
１．３ 统计与分析
将扩增的ＰＣＲ产物全部上样６％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，在３５０ Ｖ电压下电泳约１４０ ｍｉｎ，经硝酸银染色、氢氧化钠显影，所获得的扩增条带以０、１统计建立数据库。条带统计以其清晰可重复为基本原则，采用人工读带法，在相同迁移位置上有带记为１、无带记为０。在ＮＴＳＹＳ ２．１０ｅ分析软件中，根据ＳＭ相似系数法求得品种间的遗传相似性矩阵，再用非加权组平均法（Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ ｐａｉｒ－ｇｒｏｕｐ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ ｍｅａｎｓ，ＵＰＧＭＡ）进行聚类分析，构建系统聚类分析树状图［８］。
２ 结果与分析
２．１ 引物筛选结果
随机选取秋焰的ＤＮＡ为模板，分别对２１条ＩＳＳＲ扩增引物进行筛选，淘汰无扩增产物和多态性差的引物，选留扩增条带清晰且有明显多态性片段的引物，结果见图１。根据琼脂糖电泳得到的初步检测结果，结合聚丙烯酰胺电泳（图２）结果的进一步分析，从中筛选出了９个引物，具体见表２。分析可见，这些引物均能在供试罗田甜柿样品中扩增出清晰、稳定、重复性和多态性较高的条带。如图１结果显示，在泳道２、３、５、７、９、１１、１３、１４、１５、１７、１８、２０、２１中均有多态性条带，说明对应编号的引物都可为ＩＳＳＲ引物筛选提供参考，因此对其他泳道没有显示多态性条带的引物予以淘汰。图２显示，泳道２、３、５、７、９、１１、１３、１４、１５、１７、１８、２０、２１的多态性条带数清晰，再结合图１初步筛选的结果，确定９条引物（表２）用于４０个罗田甜柿优系的认证和鉴定。
２．２ ＩＳＳＲ多态性分析及指纹分析
用筛选出的９个引物分别对４０个罗田甜柿样品提取的基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，经统计，共扩增出１８５条ＤＮＡ条带，其中多态性条带１８５条，平均每个引物扩增出２０．１个条带，平均多态性位点率为１００％，具体结果见表２。从表２可见，不同引物扩增出的条带数有较大的差异，如引物ＩＳＳＲ３、ＩＳＳＲ２１扩增出的条带较多，分别为２９、２７条，而引物ＩＳＳＲ７扩增出的条带数最少，仅有１４条。从表２还可见，所选择的引物多态性达１００％。９条引物能分别建立相应的ＤＮＡ指纹图谱（因为图多，文中省略），由各引物扩增效果所反映出的ＤＮＡ条带多态性能较好地区分开各个罗田甜柿的优系。
２．３ 罗田甜柿优系间的遗传相似性分析
用ＮＴＳＹＳ２．１０ｅ软件计算甜柿优系间的Ｄｉｃｅ遗传相似系数，结果见表３。由表３可知，４０个罗田甜柿优系间的遗传相似系数范围为０．３９～０．９２，平均遗传相似性系数为０．７１。以罗田县平湖乡东冲畈村在海拔１４８ ｍ处采集的１号优系样品和从罗田县大崎乡平头岭村海拔５８８ ｍ处采集的９号优系样品遗传相似性系数最大，都为０．９２，说明这２个优系亲缘关系很近，有可能源自同一株树。其次是从东冲畈村海拔９８ ｍ、平头岭村海拔４７３ ｍ处采集的３、７号优系样品，相似性系数都为０．９０，表明它们之间的亲缘关系很接近，遗传差异较小。而从平头岭村海拔５８８ ｍ处采集的９号优系样品与从罗田县三里畈镇夏家铺村海拔２９６ ｍ处采集的１３号优系样品具有最小的遗传相似性系数，仅为０．３９，可见它们之间的遗传差异比较大，亲缘关系较远。
２．４ 聚类分析
在获得两两不同优系间的Ｄｉｃｅ遗传相似系数基础上，以１８５个位点的谱带为原矩阵，采用ＵＰＧＭＡ法构建了罗田甜柿优系间的遗传关系系统聚类分析树状图，具体见图３。分析表明，聚类树状图与优系间的遗传相似系数反映出的情况基本一致，即遗传相似系数越高，亲缘关系越近，优系间的差异就越小。从树状图可以看出，４０份优系材料间的遗传相似系数范围为０．３９～０．９２，表现出丰富的遗传多样性。
当遗传相似系数为０．６０时，可将４０个优系分为Ａ组和Ｂ组２个组。在Ａ组中，麻城市的优系全都聚在该组，罗田县大部分乡镇的优系聚在了一起；在Ｂ组中，罗田县部分乡镇的少数优系单独聚在了一起，说明不同地域之间的优系存在遗传差异，处在同一乡镇的优系之间也存在遗传差异，从而表现出了该地区野生罗田甜柿的遗传多样性；当在遗传相似系数为０．６７处做割线Ｌ１时，可以将来自于不同地域的４０份资源优系分成４个亚组。其中Ａ组有３个亚组Ａ１、Ａ２、Ａ３，Ｂ组仍然单独聚类成１个亚组。
当遗传相似系数为０．７３时，来自于罗田县三里畈镇朱元洞村不同海拔的２个优系聚在了一起，独自成Ａ３亚组，说明２个优系之间遗传相似性较高，同时也说明其与来自于其他地域的类群有较远的亲缘关系；在Ａ１亚组中，来自于罗田县平湖乡东冲畈村海拔１４８ ｍ的１号优系与来自于罗田县大崎乡平头岭村海拔５８８ ｍ的９号优系在遗传相似系数为０．９２时，聚在了一起，然后又在遗传相似系数为０．８６时与来自于罗田县河铺镇丁家山村的海拔６１３ ｍ的２６号优系聚在了一起，其中１号和９号形成一支，很有可能是同一个母源。当遗传相似系数为０．９０时，来自于罗田县平湖乡东冲畈村海拔９８ ｍ的３号优系与来自罗田县大崎乡平头岭村海拔４７３ ｍ的７号优系聚在了一起；当遗传相似系数在０．６８及以上时，Ａ２亚组又可以分为２个小组，分别表述为Ａ２１小组和Ａ２２小组。在Ａ２２小组中，当遗传相似系数为０．７８时，来自于罗田县河铺镇唐家山村海拔３９７ ｍ的２２号优系与来自于同镇的丁家山村海拔５６４ ｍ的２４号优系聚在了一起；来自于罗田县三里畈镇錾字石村的２个优系２９号和３０号也在０．７９处相聚，后又在０．７５处与同样来自于錾字石村的另外一个优系２８号相聚在一起。从这个结果可以看出，野生罗田甜柿不同种源之间的差异随着地理距离的远近而大小不一。
另外，Ｂ组分别为来自于罗田县三里畈镇錾字石村不同海拔的１０号、１１号、１２号３个优系，来自于罗田县三里畈镇夏家铺村不同海拔的１３号、１４号２个优系，来自于罗田县平湖乡毛家洞村的１７号、上冲村的１８号、大垴村的２７号３个优系，等等。值得注意的是同一地域的１７号和１８号在遗传相似系数为０．８４时相聚，而同一地域的２７号与它们的遗传距离相对较远，遗传相似系数为０．６７。
从聚类图的分析中可以看出，在相同的遗传相似系数处，来自于不同地域的罗田甜柿优系可以聚在一起，说明不同的地域也会有亲缘关系比较近的优系；同样来自于同一地域的优系也会具有不同的遗传相似系数，说明同一地域的优系彼此之间是存在差异的；正是这种交叉的亲缘性和差异性才构成了罗田甜柿的遗传多样性。
３ 讨论
对于要求检测大量样品的遗传多样性研究来说，检测手段的稳定性至关重要。影响ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的因素有模版ＤＮＡ浓度、引物浓度、ｄＮＴＰ、Ｔａｑ－ＤＮＡ聚合酶、循环数、退火温度等方面［９］。徐象华等在柿属（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ Ｌ．）亲缘关系研究中完成了ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔｓ）、ＩＳＳＲ、ＩＲＡＰ（Ｉｎｔｅｒ ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＳＲＡＰ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ-ｒｅｌａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等多种分子标记技术体系的构建，侧重于研究国外与国内及国内不同地区间种间的亲缘关系［１０］。本研究采用ＩＳＳＲ标记通过对罗田甜柿不同地理位置的优系母树ＤＮＡ序列的同源程度分析，试图确定罗田甜柿种质资源分布及地理位置的遗传差异，以期为进一步的种质资源保存和优系的品种审定提供佐证。
遗传标记是作物遗传育种研究的重要工具之一，ＩＳＳＲ以其设备技术简单、重复性高、多态性丰富的特点将在果树起源进化及系统分类研究方面发挥重大作用［１１］。近年来，公共数据库的ＥＳＴ数量迅速增加，为ＩＳＳＲ标记的开发提供了一条快速而有效的途径。不过试验中由２１对引物最终仅筛选出了９对多态性高的引物，说明筛选的效率较低，其原因可能来自两方面：一是ＥＳＴ数据较少，来源单一，所设计的引物本身就存在较高的冗余度；二是中国的柿属植物种间亲缘关系较近，不易得到有多态性的引物［１２］。
果树在自然界中存在许多天然杂种，不少古老的品种是突变或者自然杂交得到的，其亲本来源不明。本次研究的供试材料为湖北省罗田县、麻城市具有优良性状的古老的罗田甜柿母树。我们应用ＮＴＳＹＳ２．１０ｅ软件对扩增结果进行ＵＰＧＭＡ法聚类分析，结果４０个罗田甜柿优系大致被分为两大类，遗传相似系数从０．３９到０．９２。说明罗田甜柿资源分布具有明显的自然地理分区，分区内又具有遗传多样性。例如从麻城市采到的优系全都聚集在Ａ区，而同一采集地的优系样品又有差异，如采自罗田县河铺镇丁家山村的２６号优系就与同样采摘于丁家山的其他２个优系（２４号、２５号）相距较远，说明相同采集地的优系也有亲缘关系较远的情况存在，这可能与早期甜柿的人工移栽种植有关［１０］。
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