田相利，何瑞鹏，钱圆，臧元奇，董双林
（中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室，山东 青岛 266003）
摘要：研究了不同温度（4、8、12、16、20、24 ℃和温度突变）下干露对刺参体壁非特异性免疫的影响。结果表明，在温度20和24 ℃条件下干露24 h后，刺参全部死亡，其余处理组刺参成活率为100%。刺参体壁水解酶类和抗氧化指标对于不同温度下干露胁迫具有不同的响应：(1) 在本研究的温度范围内，刺参体壁酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）活性总体随温度升高而增高，随干露时间的延长而逐渐下降；(2)刺参体壁中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和总抗氧化（T-AOC）活性等抗氧化指标呈现随温度的升高先增强，再逐渐下降的趋势，以16 ℃为最高。对于干露胁迫时间的响应，抗氧化酶活性等则在低温时（4～16 ℃）呈现先升高，然后逐渐下降的趋势，在高温（20和24 ℃）干露胁迫下，则呈现持续下降的趋势。（3）而模拟干法运输的刺参非特异性免疫指标的响应，总体上与12～16 ℃下干露胁迫相当，而且4～24 h之内，其AKP、SOD活性和T-AOC和MDA数值基本保持稳定。本研究结果表明，刺参干法运输中保持适当的低温可有效降低刺参的胁迫反应，提高刺参运输的成活率。
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关键词 ：刺参；温度；干露；非特异性免疫
一般来说，水生生物在其生活史中，主要生活在水体里。但是对于潮间带生物来说，可能会经常面临不同时间的离水环境条件，而多数情况下，这种干露一般很少对其生命活动造成较大伤害。然而，大部分水生生物一般不能直接利用空气中的氧气，这种短时间的干露条件对于其体温的维持和氧气的获得必然会产生很大影响。这样，在干露条件下，这些水生生物必须通过一系列机体生理生化活动的调整来适应环境的变化。
刺参(Apostichopus japonicus)，属于棘皮动物门(Echinodermata)、海参纲(Holothuroidea)，具有很高的营养保健和医用价值，是我国北方重要的增养殖种类之一。在养殖生产过程中，刺参经常会遭遇干露条件，主要有两种情况：一种是在春秋季节，一定的水温条件下，许多刺参会爬到池塘浅水处，经常因换水过程或池塘的渗漏而干露在空气中一段时间；另一种是在干法运输过程中，刺参苗种和成参也可能经历一段时间长短不一的干露过程。尽管国内外对于刺参的生理生态学已有很多研究，但对于干露状态下刺参的非特异性免疫能力的状况尚未见研究。
刺参缺乏抗体介导的免疫反应，主要以非特异性免疫来识别异己物质、抵御病原体的侵袭。在逆境胁迫下会产生大量的活性氧，进而导致机体生理机能的损伤和免疫机能的破坏[1]。为了及时消除病原感染和环境胁迫的影响，维持细胞的正常代谢，生物体经过长期进化形成了完善而复杂的酶类和非酶类抗氧化保护系统[2]。酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)是动物体内参与免疫防御等活动的两种重要水解酶[3]。超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）是抗氧化系统的关键酶[4]，可用来评判机体的非特异性免疫能力[5]。总抗氧化能力(T-AOC)是衡量机体抗氧化系统功能状况的综合性指标[6-8]。MDA则是细胞氧化代谢产物，其含量高低反应机体细胞受自由基攻击的程度[9-11]。
本研究以刺参幼参为实验材料，研究了不同温度条件下干露对其体壁水解酶系统和抗氧化酶系统相关指标的影响，旨在研究干露胁迫对刺参免疫能力的影响，探讨刺参对干露胁迫适应机制，以期丰富刺参的生理生态学特征，为刺参运输方法的完善提供参考。
1材料与方法
1.1实验材料来源与驯化
刺参购于青岛即墨田横镇泊子村海参养殖基地。刺参运回后在600 L玻璃钢水槽中驯化 20 d之后，选取体长、体重相近的健康刺参进行实验[平均体重为（50±5）g]。暂养过程中，水温控制在（17±0.5）℃，盐度 （30±1）‰，海水溶解氧大于7.0 mg/L，海水中氨的浓度低于0.25 mg/L。光照周期14L∶10D。养殖用水为沙滤自然海水，每天换水 1/2并保持连续充气。按刺参体重的10%投喂配合饲料。
温度驯化在光照培养箱中进行，以每天升高或降低1.5 ℃的速度调整到各需要温度，3 d后开展实验，驯化期间光照周期为14L∶10D，连续充气，每2 d换水1/2，所换水为相同温度的水。
1.2实验设计
研究设置了6个不同的干露温度，即4、8、12、16、20和24 ℃，每个处理各包含30头刺参，平均体重为（50±5）g。刺参放在带孔泡沫隔板上，于可控温的光照培养箱内进行实验，光照强度为（80±5）lx。同时另取17 ℃暂养的刺参30头，将其直接放到4 ℃的光照培养箱中，用于模拟刺参运输过程。
1.3取样和测定方法
1.3.1取样方法分别于干露后0、2 、4、8 、12 和24 h进行取样。用医用纱布吸干刺参的体表水分后，在冰盘上将其迅速解剖，剪取刺参体壁，置于5 mL离心管中，然后放入液氮，最后转入-80 ℃超低温冰箱中保存。每个处理每次随机取4头参进行样品采集，实验期间共取样6次。
1.3.2免疫指标测定方法实验主要测定了体壁中酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性，以及微量丙二醛（MDA）含量和总抗氧化能力（T-AOC）等。
取0.2～0.5 g体壁组织样品，剪碎，加入4倍体积的冰冷生理盐水(0.86%)，制成20%匀浆，于4 ℃、10 000 g下离心20 min，收集上清液分装待测。采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定，相关免疫指标的测定方法参考试剂盒说明书进行。
酸性磷酸酶（ACP）：以每克组织蛋白在37 ℃与基质作用30 min产生1 mg酚为一个活性单位，以U/gprot表示。
碱性磷酸酶（AKP）：以每克组织蛋白在37 ℃与基质作用15 min产生1 mg酚为一个活性单位，以U/gprot表示。
超氧化物歧化酶（SOD）：以每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活性单位，以U/mgprot表示。
过氧化氢酶（CAT）：以每毫克组织蛋白每秒钟分解1 μmol的H2O2的量为一个活性单位，以U/mgprot表示。
微量丙二醛（MDA）：以每毫克蛋白所含的纳摩尔数为一个单位，以nmol/gprot表示。
总抗氧化能力（T-AOC）：以在37 ℃时，每分钟每毫克组织蛋白使反应体系的吸光度值增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位。
血清中蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法测定，以牛血清白蛋白（ＡＭＲＥＳＣＯ公司）为标准蛋白。
1.4数据处理
实验数据以平均数±标准误（Mean±S.E.）表示。利用 spss 19.0进行Two-way ANOVA分析以确定干露温度和干露时间的交互作用，同时对不同干露时间或干露温度间的实验指标进行Duncan多重比较分析（One-way ANOVA），以P＜0.05为差异显著水平。
2实验结果
2.1干露对刺参成活率的影响
不同干露温度下，刺参的成活率见表1。由表可见，经过24 h干露胁迫，在温度20 ℃和24 ℃处理组中的刺参全部死亡，其余处理组的刺参存活率为100%。
2.2干露对刺参体壁酸性磷酸酶活性的影响
不同温度干露条件下，刺参体壁中ACP活性随时间的变化见图1。可以看出，刺参体壁ACP活性高低与干露温度和时间直接相关，总体随干露温度升高表现出明显的上升趋势。除了20和24 ℃，ACP活性随干露时间的持续均呈显著的逐渐下降趋势（P＜0.05)。其中，4和8 ℃处理组刺参体壁ACP活性随时间延长一直降低，直到24 h时降低到最低值；12、16 ℃和突变处理组刺参体壁ACP活性在4 h有所上升，然后再次降低直到实验结束；20和24 ℃处理组刺参体壁ACP活性在12 h时突然升高，在24 h化皮死亡。
2.3干露对刺参体壁碱性磷酸酶活性的影响
图2为不同干露温度下刺参体壁中AKP活性随时间变化情况。可以看出，刺参体壁AKP活性高低与干露温度和时间直接相关，总体随干露温度升高表现出明显的上升趋势。其中，4、8、12 ℃和突变处理组刺参体壁AKP活性随时间延长呈逐渐降低的趋势；16 ℃处理组刺参体壁AKP活性在8 h降至最低后有所回升；20和24 ℃处理组在12 h突然升高，24 h时化皮死亡。
2.4干露对刺参体壁SOD活性的影响
不同干露温度下，刺参体壁中SOD活性随时间变化情况见图3。可以看出，刺参体壁SOD活性高低与干露温度和时间直接相关（P＜0.05）。在4～16 ℃下，刺参体壁中SOD活性总体随温度升高而升高，4～20 ℃下随干露时间延长则呈现先上升再下降的趋势，24 h时SOD活性降至最低；在24 ℃干露胁迫下，刺参体壁中SOD活性随干露时间延长呈显著下降趋势（P＜0.05）；突变处理组在0～4 h内显著降低（P＜0.05），之后则基本保持稳定。
2.5干露对刺参体壁中CAT活性的影响
不同干露温度下，刺参体壁中CAT活性随时间变化情况见图4。可以看出，刺参体壁CAT活性高低与温度和干露时间直接相关（P＜0?05）。在4～16 ℃干露胁迫下，刺参体壁中CAT活性随温度升高而升高，随干露时间延长则呈现先上升再下降的趋势；在20、24 ℃和突变处理组，刺参体壁中CAT活性随干露时间延长呈现明显下降趋势。
2.6干露对刺参体壁T-AOC的影响
不同干露温度下，刺参体壁中T-AOC数值随时间变化情况如图5所示。总体上看，在4～16 ℃干露胁迫下，刺参体壁中T-AOC随温度升高而升高，随干露时间延长则呈现先上升再下降的趋势；在20、24 ℃干露下，刺参体壁中T-AOC均随干露时间的延长而明显下降，实验结束时显著低于12、16 ℃和突变组（P＜0.05）；突变处理组在2 h内T-AOC数值显著降低（P＜0?05），之后则基本保持稳定。
2.7干露对刺参体壁MDA含量的影响
不同干露温度下，刺参体壁中MDA含量随时间变化情况见图6。总体上，不同处理刺参体壁中MDA含量随温度胁迫程度的增加而呈先下降后升高的趋势，其中，4～12 ℃下随温度升高而下降，突变处理总体低于4、8以及20、24 ℃。而MDA含量随干露时间的变化各处理有所差异。其中，16 ℃处理组则表现出先显著上升，而后波动下降的趋势；20 ℃处理组刺参体壁MDA含量在0～4 h比较稳定，然后随时间延长而显著上升（P＜0.05）；24 ℃处理组实验期间变化不大；突变处理组显著上升，但总体上比较稳定（P＜0.05）。
3讨论
在刺参的运输过程中，经常会经历不同程度的干露胁迫，而这种胁迫可能会影响刺参的成活率。在本研究中，高温干露胁迫（20 ℃和24 ℃）对刺参存活影响显著，24 h后所有个体全部死亡。
刺参属于无脊椎动物，缺少脊椎动物所具有的获得性免疫，因此刺参的免疫系统属于非特异性免疫。总体上看，刺参非特异性免疫防御体系主要包括体壁防御、体腔细胞免疫、体腔液免疫因子及补体系统等[12]。由于刺参缺少特异性免疫组织和器官，所以体腔液中的体腔细胞担负着细胞免疫和体液免疫作用[13]。而体壁组织是抵御外来病原体的第一道防线，其防御作用不仅与体内含有的海参皂甙等抗菌活性物质有关[14]，而且体壁中分布的免疫相关酶也发挥着重要作用[15-16]。目前国内外对刺参免疫系统尚缺少系统研究，关于体壁免疫相关酶的研究主要集中于相关酶的定性和定位等方面[15-16]，对体壁中酶的活性的变化还少见报道[12]。本研究首次设置了不同干露温度条件，以水解免疫系统的ACP、AKP以及抗氧化免疫系统SOD、CAT、T-AOC和MDA等作为免疫指标，探讨了不同温度下干露对刺参体壁免疫相关酶活性的影响，以期通过对刺参体壁中免疫酶活性和指标对不同温度干露的响应研究，探讨干露胁迫对刺参机体非特异免疫特性的相关影响。
研究表明，溶酶体是具有多种水解酶、对细胞吞入的物质起消化作用的细胞器，而ACP和AKP则是溶酶体酶的重要组成部分。其中，AKP是一种非特异性磷酸水解酶，能催化磷酸单脂的水解及磷酸基团的转移反应，对动物的生存具有重要的意义，而ACP则是溶酶体的标志酶。ACP和AKP在体内直接参与磷酸基团的转移和代谢，并与一些营养物质的消化吸收密切相关[17]。作为刺参体内参与免疫防御等活动的重要水解酶，二者在刺参抵抗疾病、免疫反应和细胞损伤与修复过程中都起着重要的、不可或缺作用[3]。在本研究中，可以看出随着干露温度的升高，刺参体壁ACP和AKP活性均呈随温度升高而升高的趋势，而随干露时间的延长，ACP和AKP活性均呈逐渐降低的变化趋势。ACP和AKP活性的变化表明，长时间的干露胁迫会显著抑制刺参体壁中参与免疫的水解酶的活性，从而降低刺参机体对外源异物的防御能力和体内物质的代谢能力。实验中，ACP和AKP活性在20和24 ℃下胁迫12 h时均出现了一个反弹的过程，刺参个体在24 h时全部死亡，可能与刺参干露胁迫时间过长有关。
动物机体的抗氧化水平，在一定程度上反映机体的健康状况。氧自由基是生物在代谢过程中排除外源物质和抗应激反应时的产物之一。而SOD和CAT则是机体清除氧自由基的重要抗氧化物酶。其中，SOD是O2-主要的清除剂，能将O2-歧化为H2O2和O2，H2O2在CAT作用下则被分解成H2O和O2，从而抑制膜脂氧化，减少对膜系统的伤害[18-21]。在正常情况下，体内抗氧化酶可以清除氧化代谢产物，但当其氧化能力下降时，过量的氧自由基与不饱和脂肪酸发生脂质化氧化，就会损伤细胞膜及细胞内的大分子蛋白和核酸，从而对动物机体造成损伤 。因此，抗氧化酶系统在维持机体正常代谢和功能上起着十分重要的作用。除此以外，总抗氧化能力(T-AOC)是近年研究发现的用于衡量机体抗氧化系统功能状况的综合性指标[6-8]。T-AOC的大小可代表和反映机体抗氧化酶系统和非酶促系统对外来刺激的代偿能力以及机体自由基代谢的状态。而MDA则是细胞氧化代谢产物，其含量高低反应了机体细胞受自由基攻击的程度[9-11]。因此，SOD和CAT活性、T-AOC和MDA含量可作为机体非特异性免疫指标，来评判机体非特异性免疫能力的强弱。在本研究中，刺参体壁中抗氧化酶活性呈现变动变化趋势。随干露时间的延续，抗氧化酶活性总体上呈先上升后下降的趋势，表明在干露的最初两小时内，刺参通过提高抗氧化酶的活性来清除体内产生的大量自由基，但随胁迫时间的延续，所产生的大量活性自由基得不到及时清除，又会反过来抑制抗氧化酶的活性，低温干露胁迫下，SOD和T-AOC活性均处于较高水平；高温干露胁迫下的抗氧化酶的活性总体上呈持续下降的趋势，表明高温干露胁迫下产生的活性自由基超过了机体的抗氧化能力，抑制了抗氧化酶的活性。研究结果表明，温度胁迫会抑制刺参抗氧化酶的活性，短时间的干露胁迫可以显著提高刺参体内SOD、CAT和T-AOC的活性，这可能对增强其抗低氧能力具有一定的积极作用。
本研究表明，刺参体壁中ACP、AKP、SOD、CAT活性以及T-AOC、MDA含量是反映温度和干露胁迫对刺参非特异性免疫能力的影响的非常敏感的指标，而且不同类别的指标对于干露胁迫的响应也有所差异。总体上，在本研究的温度范围内，水解酶活性随温度升高而增加，而抗氧化酶活性则随温度的升高呈现先增强后逐渐下降的趋势，在16 ℃时最高，这一点与本研究所用规格刺参的适温范围相一致；对于干露胁迫时间的响应，水解酶类的活性随干露时间的延长而逐渐下降；而抗氧化酶活性则在低温时呈现先升高后逐渐下降的趋势，而在高温干露胁迫下，抗氧化酶类活性则呈持续下降的趋势。而模拟干法运输的刺参非特异性免疫指标的变化，总体上与12～16 ℃下干露胁迫相当，而且4～24 h之内，其AKP、SOD活性和T-AOC和MDA数值基本保持稳定。这一结果启示，刺参干法运输过程中保持适当的低温可有效降低刺参的胁迫反应，从而提高刺参运输期间的成活率。
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