尹 琼 刘 楚 吴 丹 涂 毅
（武汉东湖学院生命科学与化学学院，湖北 武汉 430212）
【摘 要】从市售酸奶中分离并鉴定了保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌（Streptococus thermophilus）。将分离出的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌以2:1的比例加入牛奶中42℃进行发酵，用考马斯亮蓝G250法测定发酵前后蛋白质含量，结果表明：蛋白质含量呈增加趋势，但仍然小于发酵前蛋白质含量，单菌发酵的蛋白质含量高于双菌的蛋白质含量。
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关键词 发酵；蛋白质含量测定；保加利亚乳杆菌；嗜热链球菌
0 引言
酸奶一般是指杀菌乳在有益菌（如保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）的作用下进行发酵所得到的乳制品。发酵完成之后，乳制品中大量存在有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。经过巴氏杀菌后再向牛奶中添加有益菌（发酵剂），经发酵后冷却灌装的一种牛奶制品。最常用的酸奶发酵菌种是保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热乳酸链球菌（Streptococus thermophilus）这两类乳酸菌。牛奶中含有很多乳糖和蛋白质，酸奶在发酵的过程中会将乳糖分解，产生乳酸导致溶液的pH值逐渐下降，使酪蛋白聚集沉降，从而形成半固体状态的凝胶体物质。本研究将从市售酸奶产品中分离到保加利亚乳杆菌和嗜热乳酸链球菌，研究凝固型酸奶的制作方法，用不同菌种发酵鲜奶，测定产品中蛋白质含量，研究酸奶发酵的规律。
材料与方法：
1 仪器与试剂
化学试剂：柠檬酸二胺，磷酸氢二钾，MgSO4·7H2O ，MnSO4·4H2O，氯化钠，乙酸钠，均为分析纯。
生物试剂：牛血清白蛋白，胰蛋白胨，酵母提取物，溴甲酚紫，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，番红染液，七叶苷，阿拉伯糖，麦芽糖，棉子糖，纤维二糖，精氨酸。
材料：光明畅优酸奶(产品标准号 GB 19302，生产许可证号QS 4201 0501 0223)，蒙牛纯牛奶（GB 19302）。
仪器：超净工作台（上海博讯），培养箱（上海新苗），光学显微镜（南京舜宇），高压灭菌锅（上海华线核医），可见光分光光度计（上海尤尼柯）。
2 实验方法
2.1 保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的分离纯化与鉴定，按照文献[1-3]中的方法进行。
2.2 接种发酵
称取5g的奶粉，溶解于100ml蒸馏水中。分装到100ml的锥形瓶中中，25ml一瓶，95℃灭菌5min。取已经分离出的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的菌液各200ul于5ml的灭过菌的鲜牛奶中，42℃培养箱中发酵。
2.3 蛋白质含量测定
分别配制浓度为0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1mg/ml的标准蛋白溶液，用考马斯亮蓝G-250[4]， 于595nm处测定各管吸光值，绘制工作曲线。然后测定自制酸奶蛋白质含量。
3 结果与讨论
3.1 乳酸菌的分离纯化与鉴定
市售酸奶的各稀释度样品液中，10-3，10-4，10-5稀释度得到单菌落的效果较好，镜检[5]观察可知，保加利亚乳杆菌菌落较大，米白色，表面不光滑，单个体呈长杆状或成链，两端钝圆，为厌氧菌，革兰氏染色为阳性；嗜热链球菌菌落小，卵圆形，乳白色，呈对或链状排列，革兰氏染色也为阳性[6]。进一步的糖发酵实验与生理生化鉴定结果如表1、表2所示。
上述表中的结果与文献[6]叙述相符。
3.2 酸奶的发酵和蛋白质含量的测定
采用考马斯亮蓝法作牛血清白蛋白的工作曲线，测定在595nm处的吸光值，结果如图1所示。吸光度y与蛋白质浓度x（mg/ml）之间的关系式为y=6.88874x+0.08864，R=0.97887，用图1的标准曲线计算自制酸奶里的蛋白质浓度。
将嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和混合双菌分别进行酸奶发酵，测定不同时间产品的蛋白质含量，结果如图2和表3所示：
从表3可以看出OD值，可以算出各个时间发酵蛋白质浓度，1h~5h的蛋白质浓度分别为14.7，17.3，19.8，23.3，28.6mg/ml，是逐渐上升的趋势，6h的蛋白质含量为26.9mg/ml，此时蛋白质含量已经开始减少，根据凝乳程度来判断发酵在24h完成，蛋白质浓度为18.6mg/ml。
用分离的菌种进行酸奶发酵的结果表明，发酵之后的蛋白质含量比发酵之前高，但是按照理论推断，牛奶在经过乳酸菌发酵，乳酸菌为了增殖是会分解牛奶中的蛋白质的，所以蛋白质含量应该是下降的。现在推断有两个方面的原因。（1）牛奶中的蛋白质虽然被分解了，但是进入细胞中是需要一个过程的，这个时候大分子蛋白质被分解为小分子蛋白质或者多个分子质量较大的多肽，而在测定蛋白质含量的时候，这些物质并未进入胞内，造成了蛋白质含量增高的假象；（2）发酵终点时，酪蛋白大量沉淀，造成在稀释样品时存在悬浮液，而染料与悬浮液的结合可能会导致蛋白质含量的测定结果偏高。
4 结论
从市售酸奶中分离纯化了保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，嗜热链球菌菌落小，成乳白色，保加利亚乳杆菌菌落较大，呈米白色，表面不光滑。对分离的菌种进行了鉴定，所分离的嗜热链球菌不能在pH9.6、6.5%NaCl条件下生长，不从精氨酸产氨，且麦芽糖、蔗糖、棉子糖发酵为阴性；所分离的保加利亚乳杆菌不从精氨酸产氨，乳糖发酵为阳性，而阿拉伯糖、麦芽糖、七叶苷、蔗糖、棉子糖、纤维二糖、核糖发酵均为阴性。所有这些检测标准均符合伯杰氏手册中对这两种菌的描述，因此判断分离菌种正确。用双菌混合发酵制作酸奶，测定了发酵过程中蛋白质的含量变化，结果表明，随着发酵时间的递增，酸奶中的蛋白质含量在发酵的初始阶段呈现先上升后下降的趋势，酸奶发酵的时间在6h之后蛋白质含量持续下降。混合菌种发酵对蛋白质的消耗明显高于单菌种。发酵完成后，蛋白质含量比发酵前要低。
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参考文献
［1］徐松斌，李威娜.酸奶中保加利亚乳杆菌的分离和鉴定[J].刊名中国乳品工业，2003，31(3):16－17.
［2］王建芳，陈芳.嗜热链球菌适宜培养条件研究[N].西北农业学报，2008，17(2):56－58.
［3］佟潇.酸奶中嗜热链球菌的分离和鉴定[J].中国乳品工业，2004，32(3):26－27.
［4］孙士青，王少杰，等.考马斯亮蓝法快速测定乳品中蛋白质含量[J].山东科学，2011，24(6):53-55.
［5］沈萍，陈向东.微生物实验[M].4版.北京:高等教育出版社，2007.
［6］R.E.布坎南，N.E.吉本斯，等.伯杰细菌鉴定手册[M].8版.北京:科学出版社.
［责任编辑：刘展］