杜 姗1 杨 唐2 赵英杰2
（1.中国海洋大学环境科学与工程学院，山东 青岛 266100；
2.青岛理工大学环境与市政工程学院，山东 青岛 266033）
【摘 要】微生物群落是生态系统中最活跃的结构单位和功能单位，因此了解各种环境中微生物的群落结构有着重要的意义，其研究的技术也一直在进步。高通量测序可以一次获得多条基因序列，使得其在环境微生物学中的研究中倍受青睐。探讨了454高通量测序早在环境微生物学中的应用。
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关键词 高通量测序；环境微生物；微生物群落结构
微生物群落是广泛存在于生态系统中的一种结构单位和功能单位，它们是生态系统内较为活泼的一部分。群落中各种不同的种群能以有规律的方式共处，进行相互作用，同时它们具有各自明显的营养和代谢类型。了解微生物群落结构的方法主要有分子生物学的方法、Biolog法以及近年来发展起来的高通量测序技术。
1 高通量测序技术
随着科技的迅猛发展，测序技术也在进步，这些测序技术可以在种的水平上对环境微生物进行分析和研究。出现在上世界70年代的Sanger测序法[1]，成本高测序通量低，成为了其广泛使用的限制因素，但它却是20世纪90年代到本世纪初期一直在使用的测序技术。
人类基因组这样庞大的序列分析工作需要，使得新一代的测序技术也发展了起来。它的特点是价格低通量高，高通量则指的是每次分析都能得到几十万或几百万条DNA的序列。454高通量测序是由454生命科学公司在了2005年开发的，2007年，该公司发布了GS FLX系统，2008年发布了它的升级GS FLX Titanium。
现在新测序技术的主要平台主要有[2]：罗氏454公司推出的GS FLX+system测序平台，Illumina公司推出的MiSeq测序平台，和ABI公司的Solid测序平台等。本研究使用的是454高通量测序技术。
454高通量测序原理[3]：它采用的是焦磷酸测序法，是4种酶催化统一体系的酶级联化学发光反应。首先将 PCR 扩增的单链 DNA与引物杂交，并与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物荧光素酶和5´-磷酸硫酸腺苷共同孵育。在每一轮测序反应中只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸。焦磷酸盐被硫酸化酶转化为ATP，ATP就会促使氧合荧光素的合成并释放可见光。CCD检测后通过软件转化为一个峰值，峰值与反应中掺入的核苷酸数目成正比。
扩增和测序可以高度保留细菌的遗传特性，是一种很常见的来确定其分类和组成的方法。通过比较现有的数据库，可确定其来自哪个生物的序列，从而确定细菌门类和各自占据的比例。
2 高通量测序技术在环境微生物中的应用
454高通量测序可以得出某个土壤区域或者生物膜中各种菌类组成，从而研究该区域微生物物种多样性；通过测序可以得到微生物的群落结构、组成，再与微生物活性、营养元素的转化等理化性质结合一起分析，来研究微生物的功能多样性。
张彩霞[4]等运用454高通量测序来研究甘肃不同地区的土壤由荒漠变成百年老农田、约30年的农田、约20年的农田、樟子松林等过程中土壤微生物群落结构变化规律及其影响因素，对比对照组的土壤发现，在由天然荒漠土壤转变成为不同利用类型的土地土壤过程中，具有从多变少再变多的趋势。在天然荒漠土壤中，微生物总量的96%以上，在土壤转变的过程中其生长受到了抑制，有4%的微生物在次过程中生长受到了促进。这个结果表明了土壤的微生物群落结构会受到土地利用类型变化的显著影响。
Michaela等[5]人利用高通量测序技术研究了森林凋谢物和土壤中微生物的细菌和真菌群落结构，对28个站点的样品进行分析，发现凋落物和土壤中存在着不同的微生物群落结构。其中，细菌的多样性要比真菌丰富，尤其是在凋谢物中，细菌群落表现出了更高的均匀度。无论是凋谢物还是土壤中的微生物群落结构，都显著受到了树种的影响。
李鑫等[6]运用高通量测序技术分析了盐碱地中，桑树与大豆单作和间作不同种植模式的土壤细菌微生物群落结构差异性。结果显示，间作时土壤的微生物多样性要比单作丰富，即间作使得土壤的微生物群落结构多样性有所提高。同时间作也改变了大豆和桑树的根基微生物群落结构。在盐碱地的种植中，间作不仅可以降低土壤碱性，还使得土壤的群落结构多样性有所提高，植物产量增加。
夏围围等[7]将新一代高通量测序技术与DGGE两种技术结合使用到了研究是新西兰典型草地和森林土壤微生物群落结构上，以16S rRNA基因为标靶, 通过两种技术来分析土壤微生物群落的结构组成和多样性，同时以此来比较两种技术的优缺点。测序分析结果显示，新西兰草地土壤检测到22门，54纲，60目，131科和350属；而DGGE却只检测到6门，9纲，8目，10科，10属，这表明了高通量测序比DGGE能更完整的表达出微生物的群落结构组成。同样的，在森林土壤也显示出了类似的规律。
3 结论
目前，高通量测序技术仍处于发展的初期，但我们可以预见，在未来几年将是第三代测序技术快速发展和三种测序技术的共存的黄金时代。测序成本将继续迅速下降。科学家们在不同的领域将可以花更少的钱测序基因组物种或转录来达到更好的实验结果和获得更多的新的发现。此外，如何分析通过高通量测序产生的大量数据和从这些数据中提取有价值的生物信息将成为未来研究的热点和重点。
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参考文献
［１］Sanger F, Nicklen S，Coulson AR. Proceedings of the National Academy of sciences of the United States of America[J].1977,74:5463-5467.
［２］Quail MA,Kozarewa I,Smith F,Scally A,StephensPJ,Durbin R,Swerdlow H,Turner DJ. Nature Methods[J].2008,5:1005-1010.
［３］Meyer M,Stenzel U,Hofreiter M.Nature Protocols[J]. 2008,3:267-278.
［４］张彩霞.新一代高通量测序技术研究土壤微生物群落结构对环境条件的影响[D].南京:南京农业大学,2012.
［５］李鑫.苏打盐碱地桑树/大豆间作的土壤微生物多样性研究[D].哈尔滨:东北林业大学,2012.
［６］夏围围,贾仲军.高通量测序和DGGE分析土壤微生物群落的技术评价[J].2014,12:1489-1499.
［７］Kailong Huang, Xu-Xiang Zhang n, Peng Shi.Ecotoxicology and Environmental Safety[J].2014,109:15-21.
［责任编辑：邓丽丽］