摘要:目的探寻一种新的中药质量控制研究模式，为中药质量控制和研究提供新的思路和视角，提升中药产品质量，促进中药产业健康发展。方法在刘昌孝院士提出的中药质量标志物(Q-Marker)理论体系下，提出化学标识物概念，寻找来源某药材(饮片)特有的而不是来源于其他药材的化学物质作为化学标识物，用于中药的真伪鉴别以及质量控制。结果与讨论分别以白薇、阿胶、皂矾作为植物药、动物药、矿物药的代表，进行了正伪品的化学标识物研究，并将其应用于女金丸、乙肝解毒胶囊等制剂中，在国家药品评价性抽验中发挥了重大的作用。
关键词:中药;质量控制;质量标志物;化学标识物
近年来，由于中药材品质的影响，国内外业界对中医药的安全性和有效性提出诸多质疑，“品质退化”、“中医将毁于中药”等说法频繁见于各种报道，中药质量成为行业关注的焦点，严重影响了中医药的声誉，也一定程度上影响了国人对中医药的“自信心”。中药质量是对中药有效性和安全性的反映和表征，是中医临床用药和中成药有效性控制的重要依据。近些年来，我国中药科技工作者为中药质量控制做了大量的工作［1-12］，我国中药质量控制水平也有了长足的进步，但现行质量标准仍存在诸多问题，难以客观评价和有效控制中药质量。
基于中药质量的复杂性及质量标准的片面性，刘昌孝院士针对中药生物属性、制造过程及配伍理论等自身医药体系的特点，于2016年提出中药质量标志物(Q-marker)的新概念［13-21］。中药质量标志物是存在于中药材和中药产品(如中药饮片、中药煎剂、中药提取物、中成药制剂)中固有的或加工制备过程中形成的、与中药的功能属性密切相关的化学物质。中药质量标志物是中药质量标准中的核心要素是质量标准能否控制中药材、饮片、提取物及制剂内在质量的关键。中药质量标志物的基本条件:①存在于中药材和中药产品中固有的次生代谢物，或加工制备过程中形成的化学物质;②来源某药材(饮片)特有的而不是来源于其他药材的化学物质;③有明确的化学结构和生物活性;④可以进行定性鉴别和定量测定的物质;⑤按中医配伍组成的方剂“君”药首选原则，兼顾“臣、佐、使”药的代表性物质。
Q-Marker是在现代科学技术条件下提出的新概念，也为中药质量控制提出了新的要求。但是中药Q-Marker的基本要求较高，不仅需要深入的药效物质基础研究，而且要求该次级代谢产物具有专属性和生物活性，同时还应有较好的色谱行为，因此中药Q-Marker需要一个系统性研究来支撑。在Q-Marker理论体系下，提出化学标识物的概念，以Q-Marker的基本条件②:寻找来源某药材(饮片)特有的而不是来源于其他药材的化学物质作为化学标识物，利用其较强的专属性和单一性，用于药材的正伪品鉴别，以及外形被破坏的提取物、配方颗粒以及中成药制剂中部分药材是否存在掺伪造假问题。
1基本体系的建立
目前，在真伪鉴别方面，中药材主要采用性状、显微、理化等方法，鉴别依据多基于分类群的性状特征分析，存在一定的局限性，尤其在中成药的应用中受到很大的限制。随着现代科学技术的发展，色谱、波谱、分子生物学技术及多维联用技术不断渗透到中药鉴定领域［22-27］。综合多种分析技术，初步建立了化学标识物研究的基础体系(图1)，用于判断中药是否存在掺伪造假问题。
在传统的中药鉴定中，粉末显微鉴别是一种重要工具，被广泛地应用于《中国药典》一部，可有效用于药材真伪的辨别。但是粉末显微鉴别方法存在一定的局限性，首先对于来源于相同科属的植物，显微特征容易存在差异不显著问题;其次，对于提取过的中药材，几乎观察不到有效的显微特征，而化学标识物则可以解决上述两个问题，广泛用于中药的真伪鉴别以及掺伪造假研究。
2中药材化学标识物的研究
从来源进行分类，中药分为植物药、动物药和矿物药。笔者分别以白薇、阿胶、皂矾为例，对植物药、动物药和矿物药进行了化学标识物研究。
2.1白薇正伪品的化学标识物研究
2.1.1仪器及材料Leica DM2500显微镜(德国徕卡公司);岛津LC－20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)，二极管阵列检测器;LC-MS-IT-TOF液相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司);Mettler AE240电子天平(瑞士梅特勒公司)。白薇及老瓜头药材为安徽亳州及河北保定药材市场收集，均经过济南市食品药品检验检测中心宋西贵主任药师鉴定。
2.1.2基原鉴定白薇为萝藦科植物白薇(Cynanchum atratum Bge．)或蔓生白薇(Cynanchum versicolor Bge．)的干燥根和根茎，目前市场上萝藦科植物老瓜头(Cynanchum komarovii Al．Iljinski)代替、冒充白薇现象普遍。白薇和老瓜头性状外观相似，结合显微、基因测序进行了基原鉴定，对药材进行了正伪品区分。
2.1.3化学标识物的确定测定条件:Kromasil 100-5 C18(4.6 mm×250 mm，5μm)色谱柱;以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱(0～7 min，10%A;7～20 min，10%A→15%A;20～35 min，15%A→23%A;35～50 min，23%A→30%A);体积流量1 mL·min－1;检测波长280 nm;柱温35℃。进样量为10μL。
供试品溶液的制备:取供试品粉末0.4 g，加甲醇30 mL，超声处理30 min，滤过，蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，滤过，取续滤液，即得。
测定:采用液相色谱法，分别建立白薇和老瓜头的指纹图谱(图2)，对二者的化学成分进行分析。通过多批次样品的分析检测，结合质谱数据，初步确定1号峰成分作为化学标识物。通过分离、制备等手段获得该物质，并采用核磁、质谱等分析技术对该成分进行结构确认，最终确定该成分为β-D-呋喃果糖基-(2→1)-α-D-［6-O-芥子酰基］-吡喃葡萄糖苷。
2.2阿胶正伪品的化学标识物研究
阿胶为马科动物驴(Equus asinus L．)的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。由于物种特性，驴成熟周期长，交配频率低，产仔率低，使得存栏量低，从而导致皮料供应远远满足不了市场需求。利益驱动和供需矛盾导致阿胶生产环境乱象丛生，普遍存在不同物种的皮源混用，甚至以工业皮下脚料进行生产的问题［28］。
胶类的主要成分为动物皮类胶原蛋白水解后形成的多肽。皮类胶原蛋白主要由Ⅰ型胶原蛋白组成，占胶原蛋白总量的80%～85%，Ⅰ型胶原蛋白又包括Ⅰ型α1、α2亚型。通过对驴、牛、马、骡等动物的Ⅰ型α1、α2胶原蛋白序列进行blast多序列比对，发现胶原蛋白COL1α2之间存在序列差异，进一步模拟胰蛋白酶酶切胶原蛋白分别获得驴皮、牛皮、马皮特征肽［29-32］，作为化学标识物。笔者对马皮特征肽进行了研究，获得化学标识物———马源寡肽A。
2.2.1化学标识物———马源寡肽A确定通过对马与驴、猪、牛、羊的Ⅰ型α1、α2胶原蛋白序列进行blast多序列比对，发现了胶原蛋白COL1α2之间的差异序列，进一步模拟胰蛋白酶酶切胶原蛋白获得一条理论的马相对于驴、猪、牛、羊胶原蛋白的特征肽—马源寡肽A(序列为GASGPAGVＲ)。
采用高分辨质谱对制备的马皮胶进行分析，将获得的数据用Thermo Proteome Discovery 2.0软件以马胶原蛋白COL1α2序列(gi|953850624|ref|XM_001492939.3)为数据库进行搜库分析，证实了马源寡肽A的存在。为了考察供应量大、价格便宜的易用于掺假的皮类原料中是否含有马源寡肽A，在NCBI数据库里进行了Blast(the basic local align-ment search tool)比对分析，结果显示，在驴、牛、猪、羊等常见家畜没有该性特征肽序列。
委托合成马源寡肽A，将马皮胶样品以及合成的马源寡肽A的提取离子流图、二级质谱图进行比较，见图3，在提取离子流图中马皮胶样品与合成的马源寡肽A色谱峰的保留时间一致，二级质谱图中离子碎片信息也一致。马源寡肽A二级质谱碎片信息归属与理论一致，见图4。
为了确证所合成马源寡肽A的序列准确性，委托公司采用Edman降解法对马源寡肽A进行了N端序列测定。结果，马源寡肽A合成品的序列为Gly-Ala-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Val-Arg(GASGPAGVＲ)，与目标特征肽序列一致。
2.2.2在阿胶杂皮投料生产问题中的应用目前阿胶的牛皮源补充检验方法就是以牛皮特征肽作为化学标识物，对牛皮投料问题进行检查;而现行的阿胶鉴别方法中，以正品阿胶作为对照药材，选择的肽段为驴、骡共有，专属性不强，无法有效鉴别是否存在骡皮投料生产问题，而以马源寡肽A作为化学标识物，对阿胶进行检查，可以有效检测出是否存在马皮和骡皮代替驴皮投料问题，专属性强。
2.3皂矾正伪品的化学标识物研究
《中国药典》2015年版规定，皂矾为硫酸盐类矿物水绿矾的矿石，主含含水硫酸亚铁(FeSO·7H O)。目前市场上流通的皂矾多为化学合成品，而化学合成品FeSO·7H O多为酸法钛白粉生产的副产品，除了含有硫酸亚铁外，还含有多种杂质，安全性无法得到保证。笔者对市售皂矾进行了研究，获得化学标识物-二氧化钛。
2.3.1仪器及材料OPTIMA8000电感耦合等离子体发射光谱仪(美国PE公司);MAＲS 6微波消解仪(美国CEM公司);Mettler AE240电子天平(瑞士梅特勒公司)。钛标准溶液购自国家有色金属及电子材料分析测试中心(标准物质号:GSB 04-1757-2004，批号:187022，标准值:1 000μg·mL－1)，皂矾样品均为安徽亳州及河北保定药材市场收集。
2.3.2化学标识物-二氧化钛的确定采用ICP-OES法对20批市售皂矾的TiO2含量进行测定。结果，20批皂矾中二氧化钛含量存在显著差异。进行主成分分析［33］，可以发现20批样品明显分为两类，13批样品聚为一类，TiO2含量在0.22%～0.90%之间，平均值为0.5%;其他7批聚为一类，TiO2含量在0.000 3%～0.000 7%之间，平均值为0.000 5%，两类皂矾中TiO2含量差异显著，平均值约相差1 000倍，20批皂矾的含量测定结果见表1。因此，可以二氧化钛作为化学标识物对皂矾和化学合成品进行区分。
对于主成分分析图中合成皂矾样品离散程度较大问题，合成皂矾是酸法钛白粉生产的副产品，相关企业进行净化处理可以达到不同的纯度，用于净水、饲料、添加剂等不同的用途，不同纯度的合成皂矾中二氧化钛含量存在较大差异，因此出现检测数据离散程度较大问题。
2.3.3在不同来源皂矾鉴别中的应用目前皂矾现行质量标标准中的检验项目无法对天然皂矾和合成皂矾进行区分，而以二氧化钛作为化学标识物进行检查，可以有效区分皂矾的来源。
3化学标识物研究在中成药中的应用
中成药的处方药味一般较多，多种药味混合在一起，常用的基于药材的鉴别方法容易受到限制，鉴别效果不理想，而化学标识物方法由于其较强的专属性和单一性，更加适用于中成药。以本研究的化学标识物为代表，在相关中成药中进行应用研究。
3.1女金丸中老瓜头代替白薇投料问题的研究
3.1.1仪器及材料岛津LC－20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)，二极管阵列检测器;Mettler AE240电子天平(瑞士梅特勒公司)。女金丸样品为2017年国家药品评价性抽验样品。
3.1.2色谱条件色谱柱:Kromasil 100-5 C18谱条件:以甲醇为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱(0～10 min，20%A→30%A;10～25 min，30%);体积流量1 mL·min－1;检测波长280 nm;柱温35℃。进样量为10μL。
对照溶液的制备:取老瓜头药材粉末0.4 g，加甲醇30 mL，超声处理30 min，滤过，蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，滤过，取续滤液，即得。
供试品溶液的制备:取女金丸40 g，加硅藻土20 g，研细，称取30 g，加甲醇100 mL(蜜丸)或150 mL(水蜜丸)，超声处理30 min，滤过，蒸至近干，残渣加水10 mL使溶解，用脱脂棉滤过，滤液通过D101型大孔树脂柱(16～60目，内径为1.5 cm，柱高为15 cm)，流速1.0～1.5 mL，以水50 mL洗脱，弃去洗脱液，继用甲醇80 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，滤过，取续滤液，即得。
3.1.3测定及结果分析以β-D-呋喃果糖基-(2→1)-α-D-［6-O-芥子酰基］-吡喃葡萄糖苷作为化学标识物，采用高效液相色谱法，建立女金丸中老瓜头的检查方法，对女金丸中是否存在老瓜头代替白薇投料问题进行研究，结果发现，在2017年国家药品评价性抽验中收集到的215份女金丸样品中，111份样品中检出该成分，说明女金丸中存在老瓜头代替白薇投料问题。
3.2女金丸中阿胶杂皮投料问题的研究
3.2.1仪器及材料AB sciEX Triple Quad 6500+高效液相色谱-质谱联用仪(美国AB公司);Mettler AE240电子天平(瑞士梅特勒公司)。女金丸样品为2017年国家药品评价性抽验样品。
3.2.2测定条件色谱柱:ACQUITY UPLCBEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7μm);液相色谱条件:以0.1%甲酸乙腈为流动相A，0.1%甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱(0～25 min，3%→20%A;25～40 min，20%→50%A);体积流量0.3 mL·min－1;检测波长280 nm;柱温35℃。进样量为1μL。电喷雾正离子模式(ESI+)，多反应监测，检测离子对为m/z 386.4(双电荷)→377.3、m/z 386.4(双电荷)→322.3。
对照溶液的制备:分别精密称取牛皮特征肽对
照品和马源寡肽A对照品，加1%碳酸氢铵溶液溶解制成质量浓度为0.2μg·mL－1的对照品溶液。
供试品溶液的制备:取本品水蜜丸适量，研碎，取4.0 g，精密称定;或取大蜜丸10丸，剪碎，混匀，取7.0 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液40 mL，超声处理30 min，加1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，离心(转速为3 000 r·min－1)5 min，将上清液转移至另一离心管中，离心(转速为9 000 r·min－1)5 min，取上清液，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液100μL，置微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液(取序列分析级胰蛋白酶，加1%碳酸氢铵溶液制成每1μL中含1μg的溶液，临用前现配)10μL，摇匀，37℃恒温酶解12 h，即得。
3.2.3测定及结果分析以牛皮特征肽、马源寡肽A作为化学标识物，采用液相色谱-质谱联用法，建立女金丸中阿胶的牛源性成分和马源性成分检查方法，对女金丸中是否存在阿胶杂皮投料问题进行研究，结果发现，在2017年国家药品评价性抽验中收集到的215份女金丸样品中，25份样品中检出牛皮特征肽，121份样品中检出马源寡肽A，说明女金丸中阿胶存在杂皮投料问题。
3.3乙肝解毒胶囊中合成皂矾代替天然皂矾投料问题的研究
3.3.1仪器及材料OPTIMA8000电感耦合等离子体发射光谱仪(美国PE公司);MAＲS 6微波消解仪(美国CEM公司);Mettler AE240电子天平(瑞士梅特勒公司)。钛标准溶液购自国家有色金属及电子材料分析测试中心(标准物质号:GSB 04-1757-2004，批号:187022，标准值:1 000μg·mL－1)，乙肝解毒胶囊样品为2018年国家药品评价性抽验样品。
3.3.2结果及分析以二氧化钛作为化学标识
物，采用ICP-OES法，建立乙肝解毒胶囊中二氧化钛检查方法，对乙肝解毒胶囊中是否存在合成皂矾代替天然皂矾投料问题进行研究。结果发现，在2018年国家药品评价性抽验中收集到的128份乙肝解毒胶囊样品中，106份样品中二氧化钛超过拟定限度，存在合成皂矾代替天然皂矾投料问题。
4总结与思考
质量是中药产业的生命线，是阻碍中药现代化、国际化的瓶颈之一。中药质量研究模式方法的探索是一项长期的、逐步完善的系统工程，刘昌孝院士提出的中药质量标志物既是质量评价的核心概念，又是一个开放性的概念，以药材基原为基础、物质基础研究为支撑、Q-markers辨析为核心、质控方法为手段，构建符合中药特色的质量控制标准，可成为未来中药质量控制新模式［34］。
本实验在Q-markers理论体系下，提出化学标识物概念，寻找来源某药材(饮片)特有的而不是来源于其他药材的化学物质作为化学标识物，用于中药的真伪鉴别以及质量控制。分别以白薇、阿胶、皂矾作为植物药、动物药、矿物药的代表，进行了正伪品的化学标识物研究，并将其应用于女金丸、乙肝解毒胶囊等制剂中，在国家药品评价性抽验中发挥了重大的作用。为中药质量控制和研究提供了新的思路和视角，有利于提升中药产品质量，促进中药产业健康发展。